纯化的RNA的点杂交和狭线杂交_实验⽅法_
| 实验方法原理 | 点杂交和狭线杂交技术（Kafatosetal.1979)用于在同一固相支持物（通常为带电荷的尼龙膜）上固定几种核酸样品，然后用合适的探针与已固定的样品杂交，并由此判断靶序列的浓度。通过估计样品点发射出的信号的强度，与已知浓度的标准品信号强度进行比较，确定待测样品中靶序列的量。 | ||||||
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| 实验材料 | RNA检测样品、标准品和阴性对照探针标记与变性 试剂、试剂盒 | NaOH预杂交液RNA变性液SSC 仪器、耗材 | 印迹装置绞链仪带正电荷尼龙膜厚印透纸水浴锅 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液与溶液 NaOH(10mol/L) 预杂交液 RNA变性液 0.1XSSC(含0.1%SDS，m/V) 0.1XSSC(含1%SDS，m/V) 0.5XSSC(含0.1%SDS，m/V) 1XSSC(含0.1%SDS，m/V) 2XSSC 20XSSC 2.核酸与寡聚核甘酸 RNA检测样品、标准品和阴性对照 3.探针 探针标记与变性 4.专用设备 印迹装置 绞链仪（如Stratalinker,Stratagene;GSGeneLinker,Bio-Rad)或真空炉、微波炉 带正电荷尼龙膜 厚印透纸（如Whatman3MM,Schleicher&SchuellGB004,或SigmaQuickDraw) 预热水浴锅到68℃ 二、方法 安装印迹装置 1.切一张合适大小的带正电荷尼龙膜。用铅笔标上表示方向的记号。用水把膜简单弄湿，在20XSSC中室温泡1h。 2.在膜浸泡期间，先用0.1mol/LNaOH小心清洗印迹装置，再用无菌水洗干净。 3.把两片厚滤纸用20XSSC浸湿，再放到真空器顶部。 4.把样品槽插入装置的上部，把湿尼龙膜放在样品槽加样孔的底部，用吸管在膜的表面滚动以去除膜与装置夹层中的气泡。 5.加紧夹板，连接真空管。 6.加入10XSSC直至液面没过尼龙膜，关掉真空，再用10XSSC充满。 RNA样品准备 7.把每个RNA样品（溶解在10μl水）分别与30μlRNA变性液混合。 8.65℃温育5min，然后在冰上冷却。 9.向每个样品中加入等体积20XSSC。 10.轻轻向印迹装置中吸入10XSSC，直到淹没尼龙膜。 RNA样品的印迹和RNA在膜上的固定 11.把所有样品轻轻加入狭线中，然后轻轻吸干膜。当所有样品都铺到膜上后，每个狭线用1ml10XSSC洗两次。 12.当第二次洗膜完成后，继续轻轻吸干膜。 13.取下膜，然后用紫外交联、烘烤或微波照射把RNA固定在膜上。 固定化RNA的杂交与洗膜 14.把膜放入烤盘或杂交炉中，加入10~20ml预杂交液68℃温育2h。 15.把已变性的放射性标记的探针直接加到预杂交液中。在适当的温度下继续温育12~16h。 16.杂交完后从塑料袋中取出膜，然后尽可能快地把膜转移到室温下装有100~200mJ、1XSSC(0.1%SDS)的塑料容器中。盖紧塑料容器，放到摇床上轻摇10min。 17.把膜转移到另一个装有100~200ml的、预热到68℃的0.5XSSC(含0.1%SDS)的塑料袋中，然后在此温度下轻摇10min。 18.按步骤17重复洗膜两次，使总的洗膜次数达到三次。 19.用滤纸吸干膜，在-70℃条件下放射自显影24~48h(KodakXAR-5或相当的胶片)。钨酸盐型的增感屏比旧式稀土型的效果更好。当然，磷光成像仪也可以用来成像。 |
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发布于 ： 2021-09-09
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