代谢组学主要是对特定条件下或某一时刻细胞内代谢物进行的分析,因细胞内酶系活跃、代谢转换迅速,取样和样品制备方法显著影响分析结果的准确性、重复性。因此,做好样品的前处理是取得可靠分析结果的先决条件。根据研究对象、目的和分析技术的不同,对样品的前处理要求也不一致,不存在一种普适性的方法,样品处理方法大致分为两步:细胞淬灭和代谢物提取。

 淬灭也称为“灭活”,目的是让细胞内的酶失活,保证代谢物的轮廓“冻结”。对于胞内代谢物,由于采样或脱离培养环境后细胞内代谢状态的变化,造成代谢物种类及含量也随之发生变化,为了正确反映培养环境中细胞代谢物的真实信息,需要立即淬灭细胞,终止胞内反应。理想的淬灭技术应在保持细胞完整性的基础上确保酶迅速失活。淬灭方法包括液氮冷冻法、酸碱灭活法、快速过滤法、低温离心法、细胞刮法、冷甲醇法等。采用低温离心法及细胞刮法淬灭多种贴壁哺乳细胞,结果发现低温离心可引起细胞内大量代谢物的泄漏,不适于代谢组学研究,而细胞刮法较为理想。

 研究发现,淬灭过程会导致泄漏即细胞内代谢物的丢失,且泄漏的程度与淬灭时间、温度及加入的淬灭试剂量等有关;随着淬灭剂的加入、淬灭时间减少、离心速度加快,泄漏程度会减轻。既然代谢物泄漏在所难免,在进行样品前处理时应尽量将泄漏的影响降到最低,并注意平行操作,快速淬灭后,迅速低温离心收集样品。另外,由于受细胞种类或分析技术的影响,不同淬灭方法效果可能存在差异,在实际应用中应做全面考察,选择最佳淬灭方法。

代谢物提取 一旦代谢反应通过灭活被停止,代谢产物就需要从细胞中提取出来。根据细胞代谢组学研究层次不同,提取方法及要求也不同。如在靶标分析中,需要采用特定的方法有选择性地提取出相应的组分;而在轮廓分析中,则需尽可能提取出多种代谢物。目前许多研究者以细胞能量代谢中间产物的量为指标,对多种提取方法进行了系统考察,但因各细胞株种类、培养条件、培养基组成及细胞生理条件等不同,造成代谢物水平差异较大,至今仍没有统一的标准方法,实际中应根据化合物及实验目的的不同选择相应的提取方法。一般提取时应遵循以下原则:①以适当的回收率从细胞中提取最大量的代谢产物;②代谢物不应该遭遇任何理化修饰,将降解控制在最小范围内;③防止代谢物泄漏;④具有非破坏性。

从不同分析角度观测

1、代谢靶向分析

代谢靶向分析是针对某个或某几个特定组分的定量分析。因其焦点为特定化合物的分析,通常忽略其他大量的代谢组信息,故需要采用具有选择性的样品制备技术除去干扰物,或选择一定的数据预处理技术去除干扰物色谱峰,优化数据质量,提高方法灵敏度和代谢物浓度测定的准确性。但当目标物处于重叠色谱峰中时,需借助专门的化学计量学技术进行解析,如平行因子分析法、多元曲线分辨−交互最小二乘法(MCR-ALS)等。目前,该研究主要集中于与癌细胞能量代谢相关的化合物研究,如核苷类、氨基酸类、脂类、糖类等。

1. 代谢轮廓分析

代谢轮廓分析是对预设的一些代谢产物的定量分析,如某一结构、化学性质相似的化合物、预先选择的某些代谢途径的所有中间产物、多条代谢途径中的标志性组分等,是对大范围内的代谢物进行检测,目的是获得一套完整的、综合的代谢组轮廓,以便更直观地理解参与代谢的化合物之间以及所有酶之间的相互作用,是对细胞代谢的抽象表达。目前,采用基于NMR法的代谢轮廓分析已寻找出多种与能量代谢相关的标记物,主要涉及到糖酵解、三羧酸循环、胆碱和脂肪酸代谢等,在癌症诊断和治疗方面扮演着重要角色。此外,国内外许多研究者对各种肿瘤细胞的代谢轮廓与细胞形态学变化之间的相关性进行了研究,但细胞内的代谢组不是静态的,不同个体对外界扰动所作出的响应也存在较大的差异,使得代谢物的准确测定及其与疾病的相关性研究仍面临着巨大挑战。

1. 代谢组学分析

代谢组学分析是采用高通量的分析技术对限定条件下的特定生物样品中代谢组分的定性和定量,即整体性地分析生物体对内外因素做出动态应答的所有代谢物小分子。生物体在受到外源性干扰后,其所处的内环境也相应的发生改变,原本正常的代谢状态也随之发生变化。在细胞研究的层面上,其研究的是细胞受到外界扰动后胞内所有代谢物的综合表现——全局观点,通常采用现代分析方法、计算机技术及统计方法,以高通量实验和大规模的计算为特点,寻找生物体应激前后代谢差异,进而确定与疾病相关的生物标记物。

任何预测药物吸收、分布、代谢、排泄以及毒性评价成功的技术都需要关联内源性物质代谢变化来考虑药物的代谢情况,因此通过代谢组学技术不仅可研究药物本身的代谢,还可研究药物及其他外界刺激引起的内源性代谢组的变化,更能直接地反映体内生化过程,阐明药物靶点或作用机制。

癌细胞具有旺盛的代谢状态,而癌症的发生、发展亦离不开细胞周围的微环境。肿瘤生长所依赖的微环境主要包括葡萄糖、氧分及其他营养性生长因子,并呈现出明显的酸性,而乳酸盐等一些小分子物质是构成这种酸性环境的主要成分,因此乳酸盐含量增加也预示着癌症的发生。目前,国内外许多研究者考察了多种外界扰动(如低氧、营养物质、药物等)对细胞代谢的动态变化、细胞生长状态及代谢关键酶活性等的影响。

1. 代谢足迹分析

研究表明,生物体在生长过程中会分泌大量代谢物,特别在不平衡生长条件下,能分泌许多具有生理活性的初级和次级代谢物以及信号分子,这种分泌过程能清晰地反映细胞的代谢活动以及相关基因的转录和翻译水平,即细胞外代谢组学。该分析技术已成功应用于代谢组学研究中,是由英国科学家Kell等在2003年首先设计出的一种用于代谢组学细胞功能分析的新技术,其采用直接注射质谱技术,以细胞培养液为分析对象,监控细胞从生长培养基中消耗营养物以及分泌代谢物质培养基的全部过程。Kell将其定义为细胞外代谢组学,Nielsen和Oliver等引入Endo-Metabolome和Exo-Metabolome术语以区分细胞内、外代谢物。该分析技术可与细胞内代谢组研究相互补充,为进一步完善代谢组学的研究范围打下坚实基础。

代谢足迹分析与前述细胞内代谢物的分析不同,具有以下特点:①样品制备过程简便,无需淬灭及提取步骤;因细胞内代谢物是动态的,且大多数代谢物的转换速度极快,从几秒钟至几分钟,故需快速淬灭细胞以冻结新陈代谢,再采用一定的方法提取代谢物,上述实验均增加了操作上的困难,很可能造成对代谢通量的误解;②胞内某些生化反应与胞外基质相关,如复杂基质的降解反应、细胞信号传导调控等,只能通过细胞外降解产物的测定来评价;③便于考察细胞对外界物质的利用情况,优化细胞培养技术。

对细胞样本数量的要求

一般细胞量1.5*10^7及以上即可，细胞培养上清液200ul。

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