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[求助]PCR仪器的温度控制性能很重要吗?
2018-01-22
问题描述:

前言

质量标准和资格认证已经成为现代实验室的重要问题。

PCR是分子生物学领域的关键技术。不管是在基础研究还是临床诊断领域,PCR的应用越来越广泛。然而,使用PCR仪器时,消耗品和试剂对最终结果的影响还不是很清楚。但是PCR仪器温度控制的影响是很明确的。市场上众多品牌和型号的PCR仪器,在技术上有很大的不同,我们认为必须建立一个好的质量控制程序。

很多年以前,CYCLERtest公司已经开始研究PCR相关温度测试和温度变化对于PCR最终实验结果的影响。1998年,MTAS服务作为评价和认证PCR仪器温度控制的方法已经进入了Benelux市场。2002年,这套系统在全世界面世。CYCLERtest公司以温度传导测试领域的世界领导者而自豪。

温度评价的目的不仅仅是要确认仪器的质量。大多数的实验室工程师关于PCR仪器都碰到过无法解释的问题的经历,那些问题与反应混合物的组成无关。就像对于一个特定的仪器经常有不确定的表现,研究者经常抱怨“我的反应一直正常,但这台仪器怎么就出问题了?”根据我们的经验,这完全是个案,而不是两台PCR仪器共有的问题。甚至同一个品牌,同一个型号,显示出不同的温度性能,而这对实验成功至关重要。

影响PCR仪器温度控制性能主要有四种因素:

1.PCR仪器之间的差别对实验结果的影响。如前所述,没有任何两台PCR仪器的温度控制是一模一样的。相对于预设的温度模块温度总是偏高或偏低,就是同一模块不同的孔之间,温度有时也会不一样,相差可能达几摄氏度之多。一些PCR仪温度控制性能的不足造成的后果是:当PCR仪的模块温度在升温时,温度过冲或不足,不能准确的达到预设的平台温度。

2.温度控制技术的差别对实验结果的影响。导致PCR仪温度控制性能优劣的因素,首先是温度控制技术。调节PCR仪模块的温度,使其达到并保持在某一温度有很多方式。每一种方式都有优点和缺点。另外,这些技术被运用控制的水平对于温度控制的水准是很重要的,且有很大不同。大多数PCR仪器的温度控制性能是很差的。在单一或多传感器控制机制上的不同显而易见的引起了温度的不均一性。

3.仪器老化对实验结果的影响。虽然PCR仪没有任何的机械或可移动部件,但是那并不意味着它不会磨损。电子器件的性能会随着时间的延长而老化,并由于过度的使用而加速老化。Peltier器件的失效或磨损会引起模块的热斑或冷斑,通常PCR仪器不能识别这种由于机械磨损,模块延展和收缩效应引起的温控性能的不同。因此,为掌握这些情况,实时监测PCR仪的温度控制性能是重要的。出于同样的原因,PCR仪温控性能的失常通常是实验失败或毁坏循环反应的重要原因。

4.外部因素对实验结果的影响。不同PCR仪品牌与型号在温度控制性能上的不同直接影响了三种温度平台的温度的准确性和不均一性,因而影响了整个PCR反应的实验结果。另外,升温速度的不同,温度下降梯度的不均一性,温度过低,温度过冲,也是重要的因素。最差的情况,一个本该阳性的结果却可能得出阴性的结果。对于实时PCR,荧光信号输出和产量/溶解曲线,直接与温度控制有关系,而这些结果很可能是戏剧性的。

5.实验室认证。根据以上的论点,很多实验室已经不得不适应一些认证。和ISO、GMP、GLP标准一样,必须证明所有的实验室程序是按照标准程序所操作的。一些实验室只有当他们采用已经被他们的合作组织或专业委员会测试的或认可的程序时才可以称他们自己是合格的,。

DRIFTCON系统简介
硬件
该系统由探针装置组成,那是一个这样的结构:在测量之前电热调节器被放在一个固定器里,并且作为一个孔放在模块里。Driftcon箱是一个硬件模块,处理收集的信号,之后,软件系统显示结果。测量可以每天一次,每周一次或每月一次。

driftcon系统组成
driftcon硬件模块+连接电缆
目前可提供的探针装置如下表所示:(目前那还不能提供所有的探针装置)。
例:96V-16:表示16号温度传感器,适用于96*0.2ml模块
384-15:表示15号温度传感器,适用于384孔板
48V-12:表示12号温度传感器,适用于48*0.2ml模块

组成:driftcon硬件模块
探针固定箱
DRIFTCONSMART-card
DRIFTCON软件
软件

在启动Driftcon以后,一个弹出窗口显示机器在测量。

该仪器的软件可以储存每一次测量的结果,很容易重新阅读。结果显示所有的参数及参数的细节,包括精确性、升温时间、最大过冲,平均过冲和温度持续时间。持续时间指的是一个模块达到设定的温度平台的持续时间。两个最重要的参数:温度范围和精确性以六个不同的时间或时间段来表示。(10-20s,15s,25-35s,30s,85-95s,90s)。在每一个测量水平上,测量值和标准值比较,通过符号的方法,判断是对还是错。

不均一性和精确性能够在时间表中显示。在这个表格中,操作者能够通过设定的限制,及时跟踪仪器性能的进程。通过移动表中的曲线,精确值得以显示。

标准值:当设定标准值时,有两种方法。一种是选择该领域某种仪器或品牌特定的平均世界通用性能指标,或更好的指标。第二种方法是凭经验确定某种测试的边界值,并且以基值作为预先设定的标准值。这可以在菜单里操作,甚至在每一个温度平台上操作。

有三种使用操作权限:管理者、控制者和使用者。管理者可以进入所有的软件系统,可以创建其他的使用者并改变他们的设置,设定标准值,并改变其他的参数。控制者不能够做这些,但是能够添加和编辑仪器,使用者仅仅能够执行测量并观察结果。

应用

如果您正在使用实时PCR仪,并想用合适的证据,比如生物学参数、保证完全的可追溯能力以及所使用仪器的质量来证明您所得结果的正确性。因此我们强烈建议在实时PCR仪中使用DRIFTCON系统。依据内部评价表格、研究类型、所得结果的影响和重要性,您可以每日、每周或每月使用DRIFTCON,及时检测您所使用的PCR仪器的温控性能。您的试剂盒生产商也强烈推荐使用DRIFTCON系统,通过driftcon系统,您可以比较该系统是否适合您的应用。

模块的不均一性:每一个PCR仪器都有温度不均一的问题,您正在使用的PCR仪可能就有个别的热斑或冷斑。这些斑通常是通过生物学参数或通过使用内部样本参数来检测。在那种情况下,意识到荧光信号,产量和溶解曲线的结果与这些温度直接相关是重要的。例如:温度相差10C,对产生的结果和荧光信号的影响将是巨大的。

您的试剂盒生产商可能推荐DRIFTCON系统的普通使用,排除由于所使用的PCR仪器性能的不足造成的结果波动。一个试剂盒生产商,甚至可能需要在接受试剂盒投诉之前看所使用的PCR仪器的DRIFTCON简介。

不工作仪器:您的仪器可能不执行被PCR仪器测试提供的仪器参数,请通过同步我们普通的数据库要求最接近的参数。

试剂盒温度起始设置:商业试剂盒的使用者可能要求试剂盒生产商为了温度的准确性和模块的均一性,提供规定的起始温度设置。政府检察员可能要求试剂盒生产商对供应的试剂盒提供温度起始设置,还有这些资料的正确评价。

起始设置:起始设置被用来通过和规定的设置比较PCR仪器的温度性能。试剂盒生产商能够设计极其详细的温度起始设置。这些起始设置被用来检查被测试的仪器是否在应用的起始温度之内。试剂盒生产商应该提供一个清楚的定义,起始设置是基于仪器还是应用。

基于仪器的起始:仪器起始设置(一个特殊的仪器的模块型号)被用购买DRIFTCON系统而提供。其他个别的特殊的起始设置可能被购买作为可选的软件。这被提供的特殊的仪器起始是从CYCLERtest全球数据库中提取出来的。被提供的起始值是平均值加或减2倍的标准差。你可以调整通过产生不同起始设置温度的仪器来调整这些设置。

基于应用的起始设置:虽然基于应用的起始设置更困难,而且要花更多的时间设计,但它们是仪器起始温度的高级设计。换句话说,一个人要比较,被用来操作一个特定应用的PCR仪器的起始温度设计是否适合这个应用。

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huixu
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你需要什么帮助?温度对于PCR反应当然是至关重要的。变性温度差一点还说的过去,但退火温度差一点就会影响整个PCR的结果。
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longmed
  用户
我是想了解上述的仪器有没有应用价值?有必要买吗?
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huixu
  用户
需要做实验当然要买。其实现在商用化的PCR仪温度控制做的都不错,你用两个牌子的PCR仪做出的结果不一样往往不是温度控制出错,而是升降温速度这一参数不同所导致的。一般你买了一款机器,在这台仪器上一旦摸索好条件,就不用太怎么调整了,以后你也都那这款机子做实验,条件是相同的,就可以忽略这方面的因素了,除非仪器出问题,否则没什么关系。
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