Product Description
C3/C5-Depleted Serum is normal human serum in which C3 and C5 have been removed by immunoaffinity chromatography. The product is tested for the absence of C3 and C5 activity by testing classical and alternative pathway function and for the absence of C3 and C5 proteins by double immunodiffusion. The C3/C5-depleted serum is certified to exhibit less than 5% classical pathway and alternative pathway activities. Functional classical and alternative pathways can be reconstituted by addition of purified C3 protein (1.3 mg/mL) and C5 protein (75 ug/mL) indicating that all other complement components necessary for classical and alternative pathway activation are present. After reconstitution with C3 (1.3 mg C3/mL) and C5 (0.75 mg/mL), the C3/C5-Depleted Serum is certified to possess a functional classical and alternative pathway for complement activation (Morgan, B.P. (2000); Dodds, A.W. and Sim, R.B. (1997)). Although a functional lectin pathway should also be reconstituted by the addition of similar concentrations of C3 and C5, the function of this pathway is not tested.
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Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。
中文名
荧光素酶报告基因
外文名
Luciferase
底 物
荧光素(luciferin)
生物荧光
bioluminescence
转录因子
反式作用因子
转录因子
行使调控基因表达的蛋白质分子
简介
Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
应用原理
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式作用元件,转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
其原理简述如下:
(1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒,如pGL3-basic等。
(2) 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子,则荧光素酶基因就会表达,荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
(3) 加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应,产生荧光,通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性,从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
技术流程
(1) 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
(2)设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒(pGL3-basic)中。
(3)筛选阳性克隆,测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
(4) 扩增转录因子质粒,提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照,提纯备用。
(5) 培养293(或其它目的细胞),并接种于24孔板中,生长10-24小时(80%汇合度)。
(6) 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
(7)提取蛋白并用于荧光素酶检测。
(8) 加入底物,测定荧光素酶的活性。
(9) 计算相对荧光强度,并与空载对照比较。
发展
双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时, 通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供 PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们体会到该系统的便利。
体外分泌的荧光素基因:目前NEB公司提供新型的可在细胞外分泌的荧光素酶,分别是Gluc和Cluc,具体使用帮助可在NEB官方网站找到.展开
Luciferase
)
标记细胞或
DNA
,而荧光技术则采用绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等荧光报告基因和
FITC
、
Cy5
、
C
y7
等荧光素及量子点
(quantumdot
,
QD)
进行标记。
小动物活体成像技术是采用高灵敏度制冷
CCD
配合特制的成像暗箱和图像处理,使得可以直接监
控活体生物体内的细胞活动和基因行为。实验者借此可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、
感染性
疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。
由于具有更高量子效率
CCD
的问世,使活体动物体内光学成像技术具有越来越高的灵敏度,对肿瘤微
小转移灶的检测灵敏度极高;另外,该技术不涉及放射性物质和方法,非常安全。因其操作极其简单、
所得结果直观、
灵敏度高、
实验成本低等特点,
在刚刚发展起来的几年时间内,
已广泛应用于生命科学、
医学研究及物开发等方面
胶原酶按其存在的方式不同可分为人体内源性胶原酶和药用胶原酶两种。人体内源性胶原酶是指人体内部本身所具有的胶原酶,如牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、椎间盘内都不同程度的存在着这种胶原酶,它在体内胶原蛋白的分解过程中发挥着不可或缺的作用。药用胶原酶是指利用生物制药的高科技手段从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂。
根据酶催化反应最适条件的要求,原则上在酶测定体系中应加入一定量的辅助因子。辅助因子(cofactors)是指酶的活性所需要的一种非蛋白质成分,包括辅酶、辅基和金属离子激活剂。与酶紧密结合的辅因子称为辅基;不含辅基的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白(apoenzyme),没有催化活性,必须加入足量辅基,和它结合成为全酶(holoenzyme),才有催化活性。脱辅基酶蛋白与辅基孵育一段时间后,酶活性才会恢复,因此,往往需要样品与试剂中的辅基先预孵育的过程。辅基的用量往往较少。
与酶蛋白结合很松弛,用透析和其它方法很易将它们与酶分开的称为辅酶(Coenzyme)。辅酶尽管不同于酶的底物,但在作用方式上和底物类似,在酶反应过程中与酶结合、分离及反复循环。辅酶用量的确定可将它们按底物处理。例如乳酸脱氢酶中辅酶按双底物动力学方程计算。
激活剂(activator)的化学本质是金属离子,可以是酶的活性中心,也可以通过其他机制激活酶的活性。作为激活剂的金属离子,其影响酶促反应的动力学更加复杂。最常见的是二价金属离子如Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等。重金属离子大多是酶的变性剂。金属离子之间往往存在相互拮抗或相互抑制。在酶测定体系中经常加入EDTA目的是螯合一部分非必要的离子。合适的金属离子浓度是必要的,过量的离子往往抑制酶反应速度。由于激活剂的动力学往往与酶的动力学不同,这就可以解释不同的样品与反应液的比例,造成酶活性测定结果的不呈比例。N-乙酰半胱氨酸对肌酸激酶的激活作用与此类似。激活剂的用量一般通过反复实验来确定。
辅酶Q-10有助于:(1)保护心脏:
辅酶Q-10有助于为心肌提供充足氧气,预防突发性心脏病,尤其在心肌缺氧过程中辅酶Q10发挥关键作用。
(2)促进能量转化,提升精力:
辅酶Q-10帮助把食物转化为细胞生存必需的能量(如ATP),使细胞保持最佳状态,使人感觉精力更充沛;
(3)提高免疫力,延缓衰老:
辅酶Q-10是细胞自身产生的天然抗氧化剂,可阻止自由基的形成,有助于维护免疫系统的正常运作及延缓衰老;
近年来的研究表明,辅酶Q-10在预防冠心病,缓解牙周炎,治疗十二指肠溃疡及胃溃疡及缓解心绞痛方面有显著效果。同时还有抗肿瘤作用,临床对于晚期转移性癌症有一定疗效。
各种辅酶在生物体正常生长发育中,发挥各种重要的作用,使生命活动有序的进行。向左转|向右转

