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Bio-Synthesis/Tyrosinase (450 - 462)/1 mg/10625-01
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Tyrosinase (450 - 462)
Sequence (1LC):
SYLQDSDPDSFQD
Sequence (3LC):
H - Ser - Tyr - Leu - Gln - Asp - Ser - Asp - Pro - Asp - Ser - Phe - Gln - Asp - OH
Catalog :
10625-01
Unit:
1 mg
Price/Unit:
$260(For other quantities please Contact Us or call 972-420-8505)
Purity:
>95%
Format:
Lyophilized solid, trifluoroacetate (TFA) salt format
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-20°C
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This product is for research use only. Not for use in diagnostic or therapeutic procedures.
M.W.:
1516.5
Reference/Citations:
Kawakami, Y. et al. J Immunol 161, 6985 (1998); Danke, N. et al. J Immunol 172, 5967 (2004); Topalian, S. et al. J Exp Med 183, 1965 (1996).
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2018-04-29
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2021-09-11
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2016-01-28
细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体而发挥生物学作用。细胞因子和其受体的结合是细胞因子介导的细胞信号转导的启动刺激。已知的细胞因子受体绝大多数是跨膜蛋白，由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成。... 查看更多
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2021-08-28
北京开景基因技术有限公司在发布的HIV2抗原，HIV2 antigen，艾滋病毒抗原2供应信息，浏览与HIV2抗原，HIV2 antigen，艾滋病毒抗原2相关的产品或在搜索更多与HIV2抗原，HIV2 antigen，艾滋病毒抗原2相关的内容。 查看更多
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peprotech细胞因子注意事项 目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而... 查看更多
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2021-09-10
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2018-07-17
小鼠凝血因子Ⅷ相关抗原试剂盒，进口试剂盒http://www.aatbio.com.cn/小鼠凝血因子Ⅷ相关抗原试剂盒用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。一般医院、制药企业使用。核酸提取纯化类、蛋白检测类、RNA。abcamhttp://www.aatbio.com.cn/goodsid/fenleiyi/3200090_abcam/1.htmlabihttp://www.aatbio.com.cn/goodsid 查看更多
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2018-07-17
人糖连抗原153试剂盒，进口试剂盒http://www.aatbio.com.cn/人糖连抗原153试剂盒用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。一般医院、制药企业使用。核酸提取纯化类、蛋白检测类、RNA。abcamhttp://www.aatbio.com.cn/goodsid/fenleiyi/3200090_abcam/1.htmlabihttp://www.aatbio.com.cn/goodsid/fenle 查看更多
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2021-09-12
细胞因子是由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。 细胞因子PCR Array可以测定多个重要的细胞因子基因，这些基因包括干扰素、白介素、骨形成蛋白和TGF-ß家族成员、... 查看更多
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2016-07-29
促炎性细胞因子、前炎性细胞活素（proinflammatory cytokines）... 查看更多
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上海泽叶生物科技有限公司在发布的沉默调节蛋白2(SIRT2)重组蛋白供应信息，浏览与沉默调节蛋白2(SIRT2)重组蛋白相关的产品或在搜索更多与沉默调节蛋白2(SIRT2)重组蛋白相关的内容。 查看更多
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肿瘤标志物：癌胚抗原（CEA）的正常值和意义是什么？ 康复之路抗...123
免疫学小弟2021-07-21
肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）的正常值在人体内到底是多少？其界定的标准是什么呢？希望大家可以一起讨论讨...
重组血吸虫诊断抗原研究进展123
luoqingli20032004-06-17
日本血吸虫病的免疫学诊断主要包括循环抗体的检测、循环抗原的检测和循环免疫复合物的检测三个方面的内容，其中循环抗体的检测应用最为广泛。在循环抗体的检测诊断中，所用的抗原有卵抗原、虫体抗原等，而这些抗原多为粗制的虫卵与成虫抗原。血吸虫病免疫诊断方法的敏感性与特异性，除了与实验方法不同有关外，主要取决于所用诊断抗原的特性[1]。由于血吸虫生活史和组织学的复杂性，加之虫种发生过程表现的遗传差别，以及为适应环境变化而产生变异等多种原因，使得这些粗制的抗原十分复杂，易与其它病原体感染产生交叉反应[2]，造成诊断结果难以标准化，检测这种抗体几乎没有疗效考核价值[3]。国内外研究证实，使用血吸虫特异性的、纯化的重组抗原，不仅可以提高血吸虫病诊断的敏感性和特异性，而且检测抗某些特异性抗原的短程抗体，具有一定的疗效考核价值[4,5,6]。因此，应用生物技术制备基因工程重组抗原，被越来越广泛地应用于血吸虫病的临床诊断，成为一个重要的研究内容[7]。目前，研究最多的有以下几种基因工程重组抗原。
一、重组抗原31/32kDa蛋白
Rupple等用曼氏血吸虫成虫抗原作免疫印迹诊断曼氏血吸虫病，发现所有血吸虫病患者血清均可识别31/32kDa蛋白(Sm31/31)，而其他寄生虫病患者和正常人血清均不与Sm31/31反应，显示Sm31/32诊断曼氏血吸虫病具有很高的敏感性和特异性[8,9]。Rupple(1987)和石佑恩等[10]采用免疫印斑试验(immunoblot)证实日本血吸虫亦含有31/32kDa蛋白(Sj31/32)。纯化的Sm31/32和Sj31/32蛋白诊断血吸虫病具有较高的特异性和敏感性，且检测抗Sj31/32蛋白的特异性IgG1和IgG4具有疗效考核价值。Klinkert等[11]提取成虫mRNA，构建成虫CDNA文库，表达出以β-半乳糖苷酶融合蛋白形式的血吸虫蛋白，用斑点印迹法检测，发现融合蛋白诊断血吸虫病具有较高的敏感性和特异性。舒新华等[12]表达了重组日本血吸虫32kD抗原(rSj32)，纯化的重组32kDa蛋白诊断日本血吸虫病具有很高的敏感性和特异性，可代替虫源性抗原（AWA和SEA）用于血吸虫病诊断。
二、重组抗原22.6kDa蛋白
张桂筠等对日本血吸虫中国大陆株(江西地理株)成虫cDNA库的免疫学筛选,获得了克隆化基因λSj514和表达克隆pGSj24[13]。核苷酸序列的同源性分析表明,pGSj24克隆所表达的重组蛋白确为日本血吸虫的蛋白成分,其基因与日本血吸虫22.6kDa蛋白基因同源性达95%，证明pGSj24表达蛋白为日本血吸虫22.6kDa蛋白[14]。rSj22.6kDa蛋白经免疫原性鉴定，该蛋白具有特异性[15]。
三、重组GST-DH融合蛋白
朱荫昌等根据Sm23的基因序列设计引物，成功地从日本血吸虫中国大陆株cDNA库中扩增出日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白基因片段，并获得了日本血吸虫中国大陆株Sj23含657bp的基因序列，经序列分析证实此基因片段的核苷酸序列与曼氏血吸虫23kDa膜蛋白基因序列有79.5的同源性，与日本血吸虫菲律宾株23kDa膜蛋白具有100的同源性[16]，预示着此两分子具有相似的免疫学特性。余传信[3]等通过重组表达及亲和层析方法，制备了纯的重组日本血吸虫中国大陆株23kDa分子的大亲水肽段与GST的融合蛋白(GST2HD)分子，以此蛋白分子作为抗原对血吸虫病人血清、肝吸虫病人血清及健康人血清进行了ELISA检测，血吸虫病人阳性检出率为95.55%，与肝吸虫的交叉反应率为零，健康人无假阳性出现。而用SEA检测相同的血清样本，血吸虫病人的阳性检出率为93.33%，与肝吸虫的交叉反应率为3.44%，健康人的假阳性率为2.5%，重组GST2HD融合蛋白分子用于血吸虫病诊断的敏感性及特异性与SEA相似。分别用GST2HD融合蛋白和SEA分子对配对的治疗前与治疗后半年的同一病人血清进行检测，治疗后半年抗GST2HD特异性IgG的阴转率达到75.0%，表现为较高的阴转率，而治疗半年后抗SEA抗体的阴转率仅为12.5%，表明抗SjC23分子特异性抗体IgG是在治愈后阴转率较快的一种短程抗体，检测这种短程抗体具有较高的疗效考核价值。
四、重组抗原14-3-3蛋白
现已知14-3-3蛋白质是一组高度保守的多功能蛋白质,广泛分布于从植物到哺乳类动物等真核生物细胞内。14-3-3在动物体内主要存在于神经组织内,在神经细胞分化、系统发育和功能方面起着至关重要的作用[17]。汪学龙等[18]通过体外扩增和克隆了Sj14-3-3抗原编码区基因,并进行了序列测定。李德发等[19,20]体外扩增、克隆了日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3(Sj14-3-3)编码基因，成功地将Sj14-3-3基因定向克隆到高效原核表达质粒pET28a中，并将重组质粒转化到E.coliBL21中，37℃下经1mmol/LIPTG诱导，2h后sj14-3-3便以融合蛋白的形式得到高效表达。该蛋白的理论分子量为28.9kDa，加上融合蛋白约3.5kDa，表达蛋白的分子量约为32.4kDa。Westernblot结果显示，表达蛋白能被免疫血清特异性识别，说明融合蛋白中有14-3-3，且含有高度保守的氨基酸序列；表达蛋白能被重感染兔血清识别，进一步说明融合蛋白中的14-3-3具有天然14-3-3蛋白的免疫活性。研究发现,重组Sj14-3-3(rSj14-3-3)蛋白，具有血吸虫病诊断抗原的开发价值。
五、结语
基因重组技术生产的抗原具有成分单一、特异性和敏感性高、得量大且价廉等优点,为大量制备有效的诊断和免疫保护性抗原提供了新的途径。用基因工程的方法可以生产出性质与天然抗原分子相似的蛋白组分用于诊断和保护性免疫的研究。因此,利用基因重组技术提高蛋白表达量和纯度,大量生产重组抗原取代天然抗原用于诊断和疗效考核诊断,以降低查病费用是完全可能的[12]。血吸虫多种诊断抗原的基因已被克隆，并重组表达，有些重组抗原已初步应用于血吸虫病诊断。重组抗原诊断血吸虫病具有和天然抗原相似的敏感性和特异性，并且可区别病期和考核疗效。但是，目前多数重组抗原是在原核表达系统大肠杆菌中表达，由于原核表达系统不能对表达蛋白进行正确折叠和糖基化，因而表达的重组蛋白抗原性比天然抗原低，并且某些重组蛋白难以纯化，用于诊断血吸虫病时需用大肠杆菌提取物对血清样本进行预处理，这影响了重组抗原在血吸虫病疫区的推广应用。为解决上述问题，今后重组蛋白宜采用真核表达系统（如哺乳动物细胞）表达。总之，随着分子生物学和免疫学技术的进一步发展，更多的具有诊断价值的分子抗原（或表位）将被重组表达，并广泛应用于诊断血吸虫病。
参考文献
[1]王兆军，胡薇，沈大康，等.日本血吸虫SjE16基因的原核表达及其免疫诊断应用潜能[J]，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2003，21(2):76-79
[2]冯正，裘丽姝，陈名刚，等.从平行检测和监测结果分析我国血吸虫病诊断试剂的现状[J],中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1998，16(5):321-325
[3]余传信，朱荫昌，殷旭仁，等.重组GST-HD融合蛋白用于血吸虫病诊断和疗效考核的研究[J],中国血吸虫病防治杂志，2001，13(2):82-85
[4]RuppleA，ShiYE，WeiDX，etal.SeraofSchistosomajaponicuminfectedpatientscross-reactwithdiagnostic31/32kDaproteinsofS.mansoni[J]，ClinExpImmunol，1987，69:291-298
[5]ChappellCIandDresdonMH，PurificationofcysteineproteineproteinasesfromadultSchistosomamansoni[J]，ArchBiochemBiophy，1987，256:560-566
[6]汪世平，曾宪芳，易新元.应用日本血吸虫31/32kDa抗原诊断血吸虫病[J]，湖南医科大学学报，1990，15(4):313-315
[7]张顺科,易新元,舒新华,等.重组日本吸虫成虫32kDa抗原用于疗效考核的研究[J]，实用预防医学,1999,6(3):169-171
[8]RuppleA，DiesfeldHJ，RotherU.Immunoblotanslysisofschistosomiasismansoniantigenswithseraofschistosomiasispatients：diagnosticpotentialofanadultschistosomepolypeptide[J]，ChinExpImmunol，1985，62:499-506
[9]WangShiping，ZengXianfang，YiXinyuan.Purificationof31/32kDaProtiensofadultSchistosomaJaponicumasantigens(Sj31/32)forELISAandIHA[J]，ChineseJournalofParasitology&ParasiticDiseases，1995，(1):25-31
[10]石佑恩，DellR，DiesfeldHJ，等.日本血吸虫31/32kDa诊断蛋白与血吸虫单克隆抗体和病人血清的免疫印斑反应[J]，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1988，6(4):245-247
[11]KlinkertMQ，RuppleA，BeckA.Cloningofdiagnostic31/32kilodaltonantigensofSchistosomamansoni，MolBiochemParasitol，1987，25:247-255
[12]舒新华，周金春，蔡春，等.日本血吸虫重组32kD抗原的纯化和诊断应用[J]，湖南医科大学学报，1998，23(4):331-334
[13]张桂筠，张兆松，陈淑贞，等.日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj22.6kDa基因克隆与表达的研究[J]，中国寄生虫学与寄生虫病杂志1997，15(6):326-329
[14]张桂筠，张兆松，陈淑贞，等.日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj22.6kDa的核苷酸序列分析[J]，中国寄生虫学与寄生虫病杂志1998，16(2):105-107
[15]张桂筠，张兆松，陈淑贞，等.日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj22.6kDa的免疫学活性鉴定[J]，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1998，16(1):6-10
[16]朱荫昌，余传信，殷旭仁，等.日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白分子的基因克隆与序列分析[J]，中国血吸虫病防治杂志1997，9(2):65-68
[17]SkoulakisEM，DavisRL.14-3-3proteinsinneuronaldevelopmentandfunction[J]，MolNeurobiol，1998，16(3):269-284.
[18]汪学龙，沈继龙，蒋作君.日本血吸虫14-3-3抗原编码基因的克隆及序列测定[J]，中国人兽共患病杂志2001，17(5)，45-47
[19]李德发，沈继龙，祖莹，等.日本血吸虫信号蛋白编码基因表达质粒的构建[J]，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2002，20(2):123-124
[20]李德发，沈继龙，祖莹，等.日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3在原核细胞的高效融合表达和特性鉴定[J]，中国人兽共患病杂志，2002，18(2):50-53
一、重组抗原31/32kDa蛋白
Rupple等用曼氏血吸虫成虫抗原作免疫印迹诊断曼氏血吸虫病，发现所有血吸虫病患者血清均可识别31/32kDa蛋白(Sm31/31)，而其他寄生虫病患者和正常人血清均不与Sm31/31反应，显示Sm31/32诊断曼氏血吸虫病具有很高的敏感性和特异性[8,9]。Rupple(1987)和石佑恩等[10]采用免疫印斑试验(immunoblot)证实日本血吸虫亦含有31/32kDa蛋白(Sj31/32)。纯化的Sm31/32和Sj31/32蛋白诊断血吸虫病具有较高的特异性和敏感性，且检测抗Sj31/32蛋白的特异性IgG1和IgG4具有疗效考核价值。Klinkert等[11]提取成虫mRNA，构建成虫CDNA文库，表达出以β-半乳糖苷酶融合蛋白形式的血吸虫蛋白，用斑点印迹法检测，发现融合蛋白诊断血吸虫病具有较高的敏感性和特异性。舒新华等[12]表达了重组日本血吸虫32kD抗原(rSj32)，纯化的重组32kDa蛋白诊断日本血吸虫病具有很高的敏感性和特异性，可代替虫源性抗原（AWA和SEA）用于血吸虫病诊断。
二、重组抗原22.6kDa蛋白
张桂筠等对日本血吸虫中国大陆株(江西地理株)成虫cDNA库的免疫学筛选,获得了克隆化基因λSj514和表达克隆pGSj24[13]。核苷酸序列的同源性分析表明,pGSj24克隆所表达的重组蛋白确为日本血吸虫的蛋白成分,其基因与日本血吸虫22.6kDa蛋白基因同源性达95%，证明pGSj24表达蛋白为日本血吸虫22.6kDa蛋白[14]。rSj22.6kDa蛋白经免疫原性鉴定，该蛋白具有特异性[15]。
三、重组GST-DH融合蛋白
朱荫昌等根据Sm23的基因序列设计引物，成功地从日本血吸虫中国大陆株cDNA库中扩增出日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白基因片段，并获得了日本血吸虫中国大陆株Sj23含657bp的基因序列，经序列分析证实此基因片段的核苷酸序列与曼氏血吸虫23kDa膜蛋白基因序列有79.5的同源性，与日本血吸虫菲律宾株23kDa膜蛋白具有100的同源性[16]，预示着此两分子具有相似的免疫学特性。余传信[3]等通过重组表达及亲和层析方法，制备了纯的重组日本血吸虫中国大陆株23kDa分子的大亲水肽段与GST的融合蛋白(GST2HD)分子，以此蛋白分子作为抗原对血吸虫病人血清、肝吸虫病人血清及健康人血清进行了ELISA检测，血吸虫病人阳性检出率为95.55%，与肝吸虫的交叉反应率为零，健康人无假阳性出现。而用SEA检测相同的血清样本，血吸虫病人的阳性检出率为93.33%，与肝吸虫的交叉反应率为3.44%，健康人的假阳性率为2.5%，重组GST2HD融合蛋白分子用于血吸虫病诊断的敏感性及特异性与SEA相似。分别用GST2HD融合蛋白和SEA分子对配对的治疗前与治疗后半年的同一病人血清进行检测，治疗后半年抗GST2HD特异性IgG的阴转率达到75.0%，表现为较高的阴转率，而治疗半年后抗SEA抗体的阴转率仅为12.5%，表明抗SjC23分子特异性抗体IgG是在治愈后阴转率较快的一种短程抗体，检测这种短程抗体具有较高的疗效考核价值。
四、重组抗原14-3-3蛋白
现已知14-3-3蛋白质是一组高度保守的多功能蛋白质,广泛分布于从植物到哺乳类动物等真核生物细胞内。14-3-3在动物体内主要存在于神经组织内,在神经细胞分化、系统发育和功能方面起着至关重要的作用[17]。汪学龙等[18]通过体外扩增和克隆了Sj14-3-3抗原编码区基因,并进行了序列测定。李德发等[19,20]体外扩增、克隆了日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3(Sj14-3-3)编码基因，成功地将Sj14-3-3基因定向克隆到高效原核表达质粒pET28a中，并将重组质粒转化到E.coliBL21中，37℃下经1mmol/LIPTG诱导，2h后sj14-3-3便以融合蛋白的形式得到高效表达。该蛋白的理论分子量为28.9kDa，加上融合蛋白约3.5kDa，表达蛋白的分子量约为32.4kDa。Westernblot结果显示，表达蛋白能被免疫血清特异性识别，说明融合蛋白中有14-3-3，且含有高度保守的氨基酸序列；表达蛋白能被重感染兔血清识别，进一步说明融合蛋白中的14-3-3具有天然14-3-3蛋白的免疫活性。研究发现,重组Sj14-3-3(rSj14-3-3)蛋白，具有血吸虫病诊断抗原的开发价值。
五、结语
基因重组技术生产的抗原具有成分单一、特异性和敏感性高、得量大且价廉等优点,为大量制备有效的诊断和免疫保护性抗原提供了新的途径。用基因工程的方法可以生产出性质与天然抗原分子相似的蛋白组分用于诊断和保护性免疫的研究。因此,利用基因重组技术提高蛋白表达量和纯度,大量生产重组抗原取代天然抗原用于诊断和疗效考核诊断,以降低查病费用是完全可能的[12]。血吸虫多种诊断抗原的基因已被克隆，并重组表达，有些重组抗原已初步应用于血吸虫病诊断。重组抗原诊断血吸虫病具有和天然抗原相似的敏感性和特异性，并且可区别病期和考核疗效。但是，目前多数重组抗原是在原核表达系统大肠杆菌中表达，由于原核表达系统不能对表达蛋白进行正确折叠和糖基化，因而表达的重组蛋白抗原性比天然抗原低，并且某些重组蛋白难以纯化，用于诊断血吸虫病时需用大肠杆菌提取物对血清样本进行预处理，这影响了重组抗原在血吸虫病疫区的推广应用。为解决上述问题，今后重组蛋白宜采用真核表达系统（如哺乳动物细胞）表达。总之，随着分子生物学和免疫学技术的进一步发展，更多的具有诊断价值的分子抗原（或表位）将被重组表达，并广泛应用于诊断血吸虫病。
参考文献
[1]王兆军，胡薇，沈大康，等.日本血吸虫SjE16基因的原核表达及其免疫诊断应用潜能[J]，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2003，21(2):76-79
[2]冯正，裘丽姝，陈名刚，等.从平行检测和监测结果分析我国血吸虫病诊断试剂的现状[J],中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1998，16(5):321-325
[3]余传信，朱荫昌，殷旭仁，等.重组GST-HD融合蛋白用于血吸虫病诊断和疗效考核的研究[J],中国血吸虫病防治杂志，2001，13(2):82-85
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[8]RuppleA，DiesfeldHJ，RotherU.Immunoblotanslysisofschistosomiasismansoniantigenswithseraofschistosomiasispatients：diagnosticpotentialofanadultschistosomepolypeptide[J]，ChinExpImmunol，1985，62:499-506
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[15]张桂筠，张兆松，陈淑贞，等.日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj22.6kDa的免疫学活性鉴定[J]，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1998，16(1):6-10
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[19]李德发，沈继龙，祖莹，等.日本血吸虫信号蛋白编码基因表达质粒的构建[J]，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2002，20(2):123-124
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牙周膜干细胞的培养和鉴定 123
我来看看862018-03-01
基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。
基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。
基因敲除的技术路线如下：
（1）构建重组基因载体﹔
（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内﹔
（3）用选择培养基筛选已击中的细胞﹔
（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。
基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低，约为百万分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作。因此，同源重组的筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题。目前已有多种筛
基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。
基因敲除的技术路线如下：
（1）构建重组基因载体﹔
（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内﹔
（3）用选择培养基筛选已击中的细胞﹔
（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。
基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低，约为百万分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作。因此，同源重组的筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题。目前已有多种筛
动物血清的作用_完美作业网_www.wanmeila.com123
十一班的一2018-03-20
使用大动物血液生产血清白蛋白大概有五方面优点:技术要求较低; 产量大(如果养殖规模大的话); 可以反复生产(抽完一次血过一个时期又可以抽); 目的蛋白组分及结构较明确(相对于重组细菌发酵生产白蛋白来说);生产方法固定(参见药典,或相关生产GMP).
事实上,现在多数药用级别白蛋白都是用血清生产的.
白蛋白的销售方向若是面向实验室,可采用重组质粒转到微生物发酵的方法生产,对土地面积的要求小,更集约,成本效率更高.
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细胞因子的检测方法 123
阳光下的呵呵12017-10-27
临床专业本科大二新手一枚，请问一下前辈们离体的血浆里的白细胞介素的浓度的检测方法有哪些，如果能附上具体的操作步骤就更好了。谢谢。
【求助】关于半抗原与载体123
skycreeper2021-08-03
哪个牌子的生长因子活性最好?生长因子效果那么好,为什么在一些...123
2017-10-12
我用过雅莎尔的修复因子，感觉不错！
哪家做生物技术服务蛋白表达与纯化和Western blot服务态度好,性价比高...123
H墨白2021-07-21
你可以咨询下武汉普健生物,已经在他那做了几个蛋白,优先提供的上清表达的蛋白,实验的活性比预期的还好些
实验教学中颗粒性抗原与可溶性抗原制备抗血清的方法及其应用 ...123
晨曦Hoo¨001242017-10-03
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原.
颗粒型抗原,除了有细菌、红细胞、螺旋体等天然颗粒型抗原,还有吸附有可溶性抗原的非免疫相关颗粒.
颗粒性抗原光镜下可见，比如细菌性抗原、红细胞抗原等；而可溶性抗原在光镜下不可见，如组织浸出液、细菌毒素、蛋白质分子等。
它们不等同于完全抗原和不完全抗原。完全抗原具有免疫原性和抗原性，而不完全抗原只具有抗原性。完全抗原可以是颗粒性抗原，亦可是可溶性抗原，而不完全抗原一般只能是可溶性抗原，不会是颗粒性抗原。
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它们不等同于完全抗原和不完全抗原。完全抗原具有免疫原性和抗原性，而不完全抗原只具有抗原性。完全抗原可以是颗粒性抗原，亦可是可溶性抗原，而不完全抗原一般只能是可溶性抗原，不会是颗粒性抗原。
抗原的概念是什么?123
尼姑c022021-08-04
所属学科：免疫学（一级学科）；概论（二级学科）；抗原（三级学科） 定义2：能使人和动物体产生免疫反应的一类物质，既能刺激免疫系统产生特异性免疫反应，形成抗体和致敏淋巴细胞，又能与之结合而出现反应。通常是一种蛋白质，但多糖和核酸等也可作为抗原。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科） 定义3：能激发机体产生体液免疫或（和）细胞免疫，且能与免疫应答的产物（抗体或致敏淋巴细胞）相结合并发生反应的物质。 所属学科：水产学（一级学科）；水产生物病害及防治（二级学科） 定义4：能够诱导免疫应答并能与相应抗体或T细胞受体发生特异反应的物质。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞免疫（二级学科）
【求助/交流】做ELISA测效价的时候包被抗原浓度问题 分子生物...123
langfeng2008-02-28
抗肿瘤特异性抗原预防接种方法的设计和评价_实验方法_123
ncmc19992003-12-14
这是我以前翻译的一外文综述，外文现在找不到了，拿出来大家看看，是否有用
“抗肿瘤特异性抗原预防接种方法的设计和评价”
抗肿瘤特异性抗原预防接种方法的设计和评价
我们通过对临床前期小鼠模型的研究，对癌症患者应用肿瘤特异性接种的效果和安全性做出评价。第一批临床实验显示接种的方法是安全的，然而临床应答特别是由疫苗引起的免疫应答仍然缺乏。实际上很多实验到目前为止完成晚期癌症患者的很少，患者期待着抗肿瘤疫苗的巨大功效。另外在自然和疫苗导致的T细胞免疫方面的研究还有待更大的改进。
缩写
APC抗原递呈细胞
CEA癌胚抗原
CTL细胞毒性T细胞
HPV人乳头状瘤病毒
PBMC外周血单核细胞
引言：特异性抗原接种的概述
在抗肿瘤预防接种的开发应用上，免疫学家和肿瘤学家分成了两派：一派利用整个肿瘤细胞作为疫苗，另一派把特定的抗原作为疫苗。
特别是自体固有肿瘤细胞的存在，肿瘤细胞基础疫苗的优点是大体上包括了所有肿瘤相关抗原，至少在疫苗设计上不需要预先识别疫苗中的肿瘤抗原。然而，既然肿瘤细胞基础疫苗的抗原复合物是非常复杂且特征不明显，这就使得在对癌症的治疗效果和副作用上的解释非常困难。
在不同的鼠肿瘤模型中肿瘤细胞预防接种的保护作用显示出来，包括特定的T细胞应答。迄今为止，仅仅在选择的病例中发现对特定抗原的T细胞免疫与临床应答在同一位置，这也说明T细胞应答包括在临床效应中[1,2,3]。在一小部分患者中可以解释预防接种的抗肿瘤效应，但是在大量的病人中很难从有效的数据推断出这一结论。通过肿瘤细胞基础疫苗的例子，可以想象免疫疫苗设计的合理改进是多么的困难。
包含特定抗原的疫苗在应用上有了很大改进，我们发现疫苗导致的免疫与临床应答有关。我们认为特异性抗原的发展大于肿瘤细胞基础疫苗的发展。
现在评论的焦点是需要包括特定抗原和抗原复合物的疫苗简单化，除此之外，有一个准确的方法对疫苗导致的T细胞应答进行评价也是重要的。
疫苗中靶抗原的结构
当前收集到的肿瘤相关抗原大体上分为两部分。第一部分包括不能由正常体细胞表达的抗原，如肿瘤病毒抗原、变异或重组的细胞基因产生的基因及所谓的睾丸癌族的抗原[4]，这组抗原除肿瘤外仅在睾丸中表达。第二部分包括的是正常组织表达的抗原，在许多病例中，肿瘤起源于这些组织。
不在正常组织表达的抗原
原则上，免疫治疗中的靶抗原在自身耐受中不受约束，对这些靶抗原的应答不可能伤害正常细胞。
对B细胞淋巴瘤患者的预防接种显示，通过常见的治疗，应用肿瘤特异性免疫球蛋白独特型作为一种抗原，在几例病例中的结果支持分子赦免学说，还伴随着特异性独特型T细胞和抗体应答[5,6]。尽管这样的处理需要全部的特异性独特型及修饰过的患者疫苗，但获得的引人注目的结果显示这个艰难的程序终于成功了。
含有睾丸癌抗原疫苗的出现有很大的实用性，它是在一种人类肿瘤中发现的异位表达蛋白。MAGE-3抗原有HLA-A限制性，在临床预防接种实验中有广泛的研究。最近的三篇报道[7,8,9]证实这种疫苗含有的肽能使晚期黑色素瘤退化及引起特异性肽细胞毒性T细胞应答。目前有效的数据还不能说明临床和免疫应答之间的关系，这可能与实验选择的对象有关，选择的都是那些晚期有转移的病人，他们接种有效的可能性很小，特别是那些把单一表位作为目标的[7,8,9,10]。
子宫颈癌是由HPV引起的癌症，以HPV为靶抗原的抗肿瘤疫苗的研究很多且很受重视。迄今为止疫苗研究的焦点在HPV瘤蛋白上作为靶子的E6和E7上。疫苗对这些抗原的免疫作用偶尔在一些病例中得到证明，但还缺少有重大意义的临床应答[11-13]。不过，对这些进展期病人的研究还是有希望的。疫苗对HPV6+生殖器瘤[14]的巨大效果暗示接种的方法对早期患者是有很大益处的。
正常体细胞表达的抗原
第二类肿瘤抗原包括特殊组织抗原，诸如黑色素瘤/黑色素细胞，这些抗原广泛的表达于正常组织，虽然有时水平很低（如P53和HER-2/neu）。
用于免疫治疗的靶抗原的开发利用必须考虑以下两个因素：免疫耐受（中枢和/或外周）的存在和可能发生的对正常组织的自身免疫。这些棘手的问题目前正在集中研究。其中转基因鼠显示了自身抗原的不同表达方式和水平[15-17]。迄今为止这些模型的研究显示：只要所涉及的抗原表达的不是太高、太广，就能获得对这些自身抗原的免疫效果。
目前在对结肠直肠癌的临床接种实验中发现了三种自身抗原：P53、上皮细胞粘附颗粒（EP-CAM）和CEA[4]。其中EP-CAM和CEA可作为组织特异性抗原，其表达受正常上皮的限制。
在CEA转基因鼠和人的接种研究中发现，CEA仅对T细胞发生部分耐受，这种耐受可被特定的接种打破形成没有明显标志的自身免疫病[18,19]。
这种观点被实验者在鼠的一种自然肿瘤相关抗原（TRP2）中得到证实。尽管在鼠的实验中发现了对黑色素瘤/细胞抗原的耐受，但这种耐受可被特定免疫程序打破，这就导致了在依赖T细胞的自身免疫应答中对抗B16鼠黑色素瘤的致命作用得到有效保护[20]。
很多临床研究显示：特异性黑色素瘤/细胞抗原的自身免疫能由特异抗原接种后引起相似免疫的例子在人类已发现[1,21,22,23,24,25]。
在P53诱导的鼠中，宽型P53表位的特异CTL升高，在对正常(P53+/+)组织自身免疫缺乏的情况下，还消灭了几种不同的肿瘤。中枢耐受很可能是胸腺表达P53的结果，可能是特定P53有效的诱导阻碍了在正常组织CTL参加的免疫[27]。不过，分离的高亲和力特定CTL至少有两种HLA限制的P53表位[28,29]，特别是在结肠癌患者中发现的特异P53TH细胞参加的免疫，这些多处表达的抗原，其耐受不是绝对的[30]。
疫苗的设计：从简单到复杂
靶细胞毒性T细胞应答
肿瘤相关CTL表位的识别[31]导致最后形成了一个分子限定的特异性抗原疫苗：最小MHC-Ⅰ类限定的一个单纯人工制造肽CTL表位使不完全佐剂乳化。在一类鼠肿瘤模型的疫苗上获得了预期结果，识别许多CTL表位化合物在人类肿瘤的表达，唤起了在癌症患者身上相似的基础肽疫苗的实验。
首先进行的临床Ⅰ期研究显示：这些疫苗在晚期癌症患者身上并不能引起大的对患者不利的副作用及有效的特异肽T细胞应答[1,7,8,9,10,12,13,21,22,24,25]。显著（部分）抗肿瘤效果仅仅在一部分患者身上得到证实，而真正的治疗效果很少，除了很多病人的T细胞免疫系统的力量减弱外[9,13]，还考虑这些病人通常显示出来的高肿瘤负担。重要的是这些实验清楚的显示了预防接种这种方法在癌症的治疗上有了进展，诸如那些切除原发瘤接受预防接种作为对残留小病灶的辅助治疗的患者。
最近对MART-127-35肽预防接种的研究显示，切除高危黑色素瘤的病人，他的特异肽免疫与延长幸存者自然复发有联系[23]。
CD4+TH细胞应答
两个关于乳腺或卵巢癌患者预防接种的有趣研究[32,33]：由15-18个氨基酸组成的几条多肽构成的特异HER-2/neu疫苗可诱导CD4+TH细胞应答，由重组GM-CSF组成的化合物也被应用。在大多数的接种患者中发现除对HER-2/neu蛋白应答外，还对这些肽产生应答。有趣的是，几个病人对不包括在疫苗内的部分HER-2/neu的应答加强，这就显示HER-2/neu免疫的产生与覆盖的表位有关，这一现象首先在自身免疫病中被描述[32,33]。尽管受时间限制在幸存的病人中进行的肽接种没有得出结论，但特异HER-2/neu接种转基因鼠后，HER-2/neu+肿瘤的发展可明显抑制自发肿瘤的发生[34,35,36]。
Disis等人[32,33]临床研究的焦点在诱导肿瘤特异性TH细胞免疫，尽管与肿瘤有关的免疫并不都是MHC-Ⅱ类限制的。疫苗的设计是以疫苗导致的抗肿瘤应答的诱导效果为基础的，现在甚至瞄准了那些本身缺少MHC-Ⅱ类，在很多时候需要肿瘤特异性CD4+TH细胞合作的固体肿瘤[37]。结果，在详细的测试中出现了一个有趣的现象，那就是不仅有Ⅰ类限制还有Ⅱ类限制的抗肿瘤应答，当前为此做证描述HLA限制的肿瘤相关TH细胞表位的文章增加了。有趣的是肿瘤特异性T细胞的辅助作用更加多了，还发现相互作用的TH细胞和树突状细胞（DCs）构成了一个T细胞免疫诱导的关键位点（keyswitch），通过树突状细胞传递给原始CTL[4]。
以覆盖广泛的HLA分子目录的复合表位为目标
另一个推动疫苗发展的因素是更多的完整的复合物是以复合肿瘤抗原为目标。这就很可能增加疫苗导致的抗肿瘤应答的规模和灵活性。同时可阻止通过选择单一靶抗原丢失而发生的肿瘤逃避[38]。
最后，对癌症患者的预防接种的特殊预防作用和治疗的逻辑和经济方面的可行性很可能得益于off-the-shelf疫苗形式的发展，这种疫苗形式在特定HLA型病人的应用并未受到限制。现在争论的是抗癌疫苗应该更趋于多样化，包括不同HLA分子限制和肿瘤抗原诱导的肿瘤特异性CTL和TH的表位。
抗原组成：特定表位和整个抗原的比较
多表位疫苗
我们希望完成的特异性抗原预防接种包括多个靶表位，这就需要以下两个基础疫苗的设计：首先，多表位疫苗应包括或编码仔细选择收集到的最小的CTL和TH表位；其次，疫苗应包括或编码一个或更多的完整肿瘤抗原。
多表位疫苗一个有效提高对不同抗原诱导表位的免疫的方法，是不需要对可能的危害蛋白质如肿瘤蛋白的基因编码[39]。疫苗允许选择对ubiquitination和隐蔽T细胞表位的免疫反应，特别重要的是肿瘤相关自身抗原的耐受可能因正常组织出现明显表位而出现[32,40]。而且，APCs可能对某一在肿瘤细胞表达的表位递呈减弱，因为APCs的免疫蛋白酶和肿瘤细胞上基本蛋白酶的功能不同[41]。在基础肽疫苗，这样的表位能通过外源依赖抗原吸收和宿主APC加工在‘MHC-ready’形式上实施呈递。
尽管需要宿主APCs的加工，编码插入序列定位的最小T细胞表位的串珠形式的重组疫苗的作用是允许抗原加工的操纵，例如通过插入顺序的选择和遍在蛋白质（ubiquitination）加强及多表位基因产生过程的加工[42,43]。现在明白，复合表位疫苗的设计需要表位方面丰富的知识，但是它提供了一个好的控制T细胞表位及T细胞诱导的指令（repertoire）。另外，疫苗中的表位顺序很容易被修饰以充分利用MHC限制性（MHC-binding）和/或免疫源性[10,44]。
整个抗原疫苗
复合表位的一个缺点是比较危险，例如疫苗上重要表位的缺失，因为这些表位迄今为止还被忽视。足够表位知识的缺乏，使组成疫苗和编码整个肿瘤抗原有一个正确的选择余地。作为对照，多表位疫苗计划离开“自然”而决定其表位由宿主APCs呈递。整个抗原疫苗的优点是：他们的principleharbor不仅有整个CTL表位，而且还有整个TH细胞表位，而且他们的应用不受病人HLA型别的限制。希望整个抗原疫苗能很快的作为“off-the-shelf”形式被应用，这种形式在选择肿瘤相关抗原时不被正常组织表达，比如病毒（viral）和睾丸癌抗原，对suBDominant和隐蔽表位的免疫需要减少。蛋白中有害物质能通过这些抗原的突变解毒而排泄出去，如HPVE6/E7联合蛋白缺少转化的能力[11]。最后，包含肿瘤相关自身抗原的整个抗原疫苗异种形式导致的免疫，在包含同基因抗原相似疫苗时失败[20,45]。
癌症疫苗设计的额外部分是在这篇评论之外的，那就是抗原的呈递模式。这些因素包括分子限定和细胞基础佐剂，炎症因子，调整APC的药物和通过TNF感受体家族表面蛋白的T细胞感应，DNA的选择和病毒基础疫苗带有者（在别处曾有广泛的评论）[4]。
疫苗导致T细胞免疫的正确评价
迄今为止，病人出现疫苗引起的应答和临床应答相联合的还是缺乏的。在这些研究里对接种实验的免疫评价方法有了清楚的规划。在当前的文献和我们自己实验里有效数据的基础上，我们提出疫苗引起抗肿瘤免疫的测试方法，详述如下。
CTL应答的测试
特异性CTL免疫在试管内测试结果，IFN-γELISPOT测试包含了潜伏的主要PBMCs的一个或多个最小肽表位，其结果是灵敏的，可信赖的[23,24,46]。多表位疫苗靶肽的选择在ELISPOT测试中是被支持的，而整个抗原疫苗包含了大量的肽，例如，被利用的所有预测的表位或一套完整的重叠的肽[47]。自体移植细胞（单核白细胞系）由带菌者（viralvectors）感染，编码interest抗原或control抗原作为独特刺激细胞服务。在这里应答比较弱，在试管里单一刺激被考虑在内[48,49]。
监视选择肽的CTL免疫，用HLA-四聚体染色由荧光活性细胞（FACS）组成一个elegantadditionapproach。在急性应答或慢性感染者新鲜PBMC的样品中很快发现了CTL，能识别MART-1/26-35表位。HLA-A0201独特的表位CTL上出现频率很高，原因不知[46]。最近两篇报道也证实，gp-100和特异酪氨酸酶CTL在黑色素瘤患者新鲜PBMCs中发现。然而，在其他大多数的病例中，试管中四聚体细胞清除检查需要瞬间刺激[49,51-53]。在引流淋巴结中测试的淋巴细胞比在外周血中的结果要高[54,55]。
四聚体在实验抗原和自然T细胞中都发现了，而在ELISPOT测试中仅测到了记忆和效应器细胞[46,56,57]。因此，ELISPOT是一个专门辨别比较疫苗导致T细胞和幼稚及无活性T细胞的技术。四聚体的染色与试管中由IFN-R产生引起的CTL的染色相同[10,50]。
四聚物染色（Tetramer-staining）一个新的有趣的应用最近出现了：用特异性肽CTL，在淋巴和非淋巴样器官中进行探测[58]。接下来的研究将要揭示这一技术是否可行，相应的工作在鼠身上已显示可以用特异性抗原T细胞在癌症病人的淋巴结引流和活检中进行探测，这就提供了一个更好的发展方向：肿瘤特异性抗原T细胞和癌症患者的APCs之间的相互作用。
TH细胞应答的测试
对免疫中抗原特异性TH细胞的评价，正如IFN-γ和IL-4（分别测TH1和TH2免疫）ELISPOT方法短期扩散（激增）方法是比较好的[32,33]。在这些实验中，成熟抗原和幼稚T细胞释放的细胞因子可以区别开分别进行检测。依靠这些接种模型，选择短肽或一套重叠的长肽来覆盖整个感兴趣（interest）抗原（尽管昂贵）已经完成了。此外，区别低亲和力特异肽T细胞和那些能识别的自然加工抗原的生理（数量）是必不可少的。通过对APCs重组蛋白反应的测试说明interest抗原和对照（control）抗原可由同一方式产生[32]。MHC-Ⅱ类四聚体最近能被利用[59]，试管内产生的T细胞也通过细胞内对细胞因子染色被分解，这就保证了反应T细胞属于CD4+T细胞系列。
带菌者（vector）应答和体液应答的测试
上述方法的焦点在于试管中测试的对肿瘤interest抗原的T细胞免疫应答。在应用病毒进行接种的病例中，对这些病毒的应答也能被监视，这就表明疫苗是有效的。而且，在人体内对抗原免疫和迟发型过敏应答的测试也显示是大大有益的[1,33]。
最后，我们应该强调的是，抗肿瘤体液应答是重要且相对容易的，特别是在整个抗原疫苗。实际上，在鼠和临床研究中肿瘤抗原特异性免疫球蛋白应答包含了很多抗肿瘤应答[5,45,60,61]。
在所有的病例中，免疫的评价应包括相同的健康人或安慰剂对照组的测试，对每一个测试背景进行评价，保证发现的应答真正的与疾病和/或预防养生之道相联系[46]。
结论
下一代特异性抗原癌症疫苗可能发展适用于小进展阶段疾病病人的疫苗，和对自然和疫苗导致的免疫进行有效和准确的评价，意思就是癌症的免疫治疗将到来。在接下来的临床实验中将会肯定特异性抗原疫苗在病人中产生的强大T细胞免疫的能力，和与疫苗导致的免疫相关的真正治疗效果在结果中的增多。
“抗肿瘤特异性抗原预防接种方法的设计和评价”
抗肿瘤特异性抗原预防接种方法的设计和评价
我们通过对临床前期小鼠模型的研究，对癌症患者应用肿瘤特异性接种的效果和安全性做出评价。第一批临床实验显示接种的方法是安全的，然而临床应答特别是由疫苗引起的免疫应答仍然缺乏。实际上很多实验到目前为止完成晚期癌症患者的很少，患者期待着抗肿瘤疫苗的巨大功效。另外在自然和疫苗导致的T细胞免疫方面的研究还有待更大的改进。
缩写
APC抗原递呈细胞
CEA癌胚抗原
CTL细胞毒性T细胞
HPV人乳头状瘤病毒
PBMC外周血单核细胞
引言：特异性抗原接种的概述
在抗肿瘤预防接种的开发应用上，免疫学家和肿瘤学家分成了两派：一派利用整个肿瘤细胞作为疫苗，另一派把特定的抗原作为疫苗。
特别是自体固有肿瘤细胞的存在，肿瘤细胞基础疫苗的优点是大体上包括了所有肿瘤相关抗原，至少在疫苗设计上不需要预先识别疫苗中的肿瘤抗原。然而，既然肿瘤细胞基础疫苗的抗原复合物是非常复杂且特征不明显，这就使得在对癌症的治疗效果和副作用上的解释非常困难。
在不同的鼠肿瘤模型中肿瘤细胞预防接种的保护作用显示出来，包括特定的T细胞应答。迄今为止，仅仅在选择的病例中发现对特定抗原的T细胞免疫与临床应答在同一位置，这也说明T细胞应答包括在临床效应中[1,2,3]。在一小部分患者中可以解释预防接种的抗肿瘤效应，但是在大量的病人中很难从有效的数据推断出这一结论。通过肿瘤细胞基础疫苗的例子，可以想象免疫疫苗设计的合理改进是多么的困难。
包含特定抗原的疫苗在应用上有了很大改进，我们发现疫苗导致的免疫与临床应答有关。我们认为特异性抗原的发展大于肿瘤细胞基础疫苗的发展。
现在评论的焦点是需要包括特定抗原和抗原复合物的疫苗简单化，除此之外，有一个准确的方法对疫苗导致的T细胞应答进行评价也是重要的。
疫苗中靶抗原的结构
当前收集到的肿瘤相关抗原大体上分为两部分。第一部分包括不能由正常体细胞表达的抗原，如肿瘤病毒抗原、变异或重组的细胞基因产生的基因及所谓的睾丸癌族的抗原[4]，这组抗原除肿瘤外仅在睾丸中表达。第二部分包括的是正常组织表达的抗原，在许多病例中，肿瘤起源于这些组织。
不在正常组织表达的抗原
原则上，免疫治疗中的靶抗原在自身耐受中不受约束，对这些靶抗原的应答不可能伤害正常细胞。
对B细胞淋巴瘤患者的预防接种显示，通过常见的治疗，应用肿瘤特异性免疫球蛋白独特型作为一种抗原，在几例病例中的结果支持分子赦免学说，还伴随着特异性独特型T细胞和抗体应答[5,6]。尽管这样的处理需要全部的特异性独特型及修饰过的患者疫苗，但获得的引人注目的结果显示这个艰难的程序终于成功了。
含有睾丸癌抗原疫苗的出现有很大的实用性，它是在一种人类肿瘤中发现的异位表达蛋白。MAGE-3抗原有HLA-A限制性，在临床预防接种实验中有广泛的研究。最近的三篇报道[7,8,9]证实这种疫苗含有的肽能使晚期黑色素瘤退化及引起特异性肽细胞毒性T细胞应答。目前有效的数据还不能说明临床和免疫应答之间的关系，这可能与实验选择的对象有关，选择的都是那些晚期有转移的病人，他们接种有效的可能性很小，特别是那些把单一表位作为目标的[7,8,9,10]。
子宫颈癌是由HPV引起的癌症，以HPV为靶抗原的抗肿瘤疫苗的研究很多且很受重视。迄今为止疫苗研究的焦点在HPV瘤蛋白上作为靶子的E6和E7上。疫苗对这些抗原的免疫作用偶尔在一些病例中得到证明，但还缺少有重大意义的临床应答[11-13]。不过，对这些进展期病人的研究还是有希望的。疫苗对HPV6+生殖器瘤[14]的巨大效果暗示接种的方法对早期患者是有很大益处的。
正常体细胞表达的抗原
第二类肿瘤抗原包括特殊组织抗原，诸如黑色素瘤/黑色素细胞，这些抗原广泛的表达于正常组织，虽然有时水平很低（如P53和HER-2/neu）。
用于免疫治疗的靶抗原的开发利用必须考虑以下两个因素：免疫耐受（中枢和/或外周）的存在和可能发生的对正常组织的自身免疫。这些棘手的问题目前正在集中研究。其中转基因鼠显示了自身抗原的不同表达方式和水平[15-17]。迄今为止这些模型的研究显示：只要所涉及的抗原表达的不是太高、太广，就能获得对这些自身抗原的免疫效果。
目前在对结肠直肠癌的临床接种实验中发现了三种自身抗原：P53、上皮细胞粘附颗粒（EP-CAM）和CEA[4]。其中EP-CAM和CEA可作为组织特异性抗原，其表达受正常上皮的限制。
在CEA转基因鼠和人的接种研究中发现，CEA仅对T细胞发生部分耐受，这种耐受可被特定的接种打破形成没有明显标志的自身免疫病[18,19]。
这种观点被实验者在鼠的一种自然肿瘤相关抗原（TRP2）中得到证实。尽管在鼠的实验中发现了对黑色素瘤/细胞抗原的耐受，但这种耐受可被特定免疫程序打破，这就导致了在依赖T细胞的自身免疫应答中对抗B16鼠黑色素瘤的致命作用得到有效保护[20]。
很多临床研究显示：特异性黑色素瘤/细胞抗原的自身免疫能由特异抗原接种后引起相似免疫的例子在人类已发现[1,21,22,23,24,25]。
在P53诱导的鼠中，宽型P53表位的特异CTL升高，在对正常(P53+/+)组织自身免疫缺乏的情况下，还消灭了几种不同的肿瘤。中枢耐受很可能是胸腺表达P53的结果，可能是特定P53有效的诱导阻碍了在正常组织CTL参加的免疫[27]。不过，分离的高亲和力特定CTL至少有两种HLA限制的P53表位[28,29]，特别是在结肠癌患者中发现的特异P53TH细胞参加的免疫，这些多处表达的抗原，其耐受不是绝对的[30]。
疫苗的设计：从简单到复杂
靶细胞毒性T细胞应答
肿瘤相关CTL表位的识别[31]导致最后形成了一个分子限定的特异性抗原疫苗：最小MHC-Ⅰ类限定的一个单纯人工制造肽CTL表位使不完全佐剂乳化。在一类鼠肿瘤模型的疫苗上获得了预期结果，识别许多CTL表位化合物在人类肿瘤的表达，唤起了在癌症患者身上相似的基础肽疫苗的实验。
首先进行的临床Ⅰ期研究显示：这些疫苗在晚期癌症患者身上并不能引起大的对患者不利的副作用及有效的特异肽T细胞应答[1,7,8,9,10,12,13,21,22,24,25]。显著（部分）抗肿瘤效果仅仅在一部分患者身上得到证实，而真正的治疗效果很少，除了很多病人的T细胞免疫系统的力量减弱外[9,13]，还考虑这些病人通常显示出来的高肿瘤负担。重要的是这些实验清楚的显示了预防接种这种方法在癌症的治疗上有了进展，诸如那些切除原发瘤接受预防接种作为对残留小病灶的辅助治疗的患者。
最近对MART-127-35肽预防接种的研究显示，切除高危黑色素瘤的病人，他的特异肽免疫与延长幸存者自然复发有联系[23]。
CD4+TH细胞应答
两个关于乳腺或卵巢癌患者预防接种的有趣研究[32,33]：由15-18个氨基酸组成的几条多肽构成的特异HER-2/neu疫苗可诱导CD4+TH细胞应答，由重组GM-CSF组成的化合物也被应用。在大多数的接种患者中发现除对HER-2/neu蛋白应答外，还对这些肽产生应答。有趣的是，几个病人对不包括在疫苗内的部分HER-2/neu的应答加强，这就显示HER-2/neu免疫的产生与覆盖的表位有关，这一现象首先在自身免疫病中被描述[32,33]。尽管受时间限制在幸存的病人中进行的肽接种没有得出结论，但特异HER-2/neu接种转基因鼠后，HER-2/neu+肿瘤的发展可明显抑制自发肿瘤的发生[34,35,36]。
Disis等人[32,33]临床研究的焦点在诱导肿瘤特异性TH细胞免疫，尽管与肿瘤有关的免疫并不都是MHC-Ⅱ类限制的。疫苗的设计是以疫苗导致的抗肿瘤应答的诱导效果为基础的，现在甚至瞄准了那些本身缺少MHC-Ⅱ类，在很多时候需要肿瘤特异性CD4+TH细胞合作的固体肿瘤[37]。结果，在详细的测试中出现了一个有趣的现象，那就是不仅有Ⅰ类限制还有Ⅱ类限制的抗肿瘤应答，当前为此做证描述HLA限制的肿瘤相关TH细胞表位的文章增加了。有趣的是肿瘤特异性T细胞的辅助作用更加多了，还发现相互作用的TH细胞和树突状细胞（DCs）构成了一个T细胞免疫诱导的关键位点（keyswitch），通过树突状细胞传递给原始CTL[4]。
以覆盖广泛的HLA分子目录的复合表位为目标
另一个推动疫苗发展的因素是更多的完整的复合物是以复合肿瘤抗原为目标。这就很可能增加疫苗导致的抗肿瘤应答的规模和灵活性。同时可阻止通过选择单一靶抗原丢失而发生的肿瘤逃避[38]。
最后，对癌症患者的预防接种的特殊预防作用和治疗的逻辑和经济方面的可行性很可能得益于off-the-shelf疫苗形式的发展，这种疫苗形式在特定HLA型病人的应用并未受到限制。现在争论的是抗癌疫苗应该更趋于多样化，包括不同HLA分子限制和肿瘤抗原诱导的肿瘤特异性CTL和TH的表位。
抗原组成：特定表位和整个抗原的比较
多表位疫苗
我们希望完成的特异性抗原预防接种包括多个靶表位，这就需要以下两个基础疫苗的设计：首先，多表位疫苗应包括或编码仔细选择收集到的最小的CTL和TH表位；其次，疫苗应包括或编码一个或更多的完整肿瘤抗原。
多表位疫苗一个有效提高对不同抗原诱导表位的免疫的方法，是不需要对可能的危害蛋白质如肿瘤蛋白的基因编码[39]。疫苗允许选择对ubiquitination和隐蔽T细胞表位的免疫反应，特别重要的是肿瘤相关自身抗原的耐受可能因正常组织出现明显表位而出现[32,40]。而且，APCs可能对某一在肿瘤细胞表达的表位递呈减弱，因为APCs的免疫蛋白酶和肿瘤细胞上基本蛋白酶的功能不同[41]。在基础肽疫苗，这样的表位能通过外源依赖抗原吸收和宿主APC加工在‘MHC-ready’形式上实施呈递。
尽管需要宿主APCs的加工，编码插入序列定位的最小T细胞表位的串珠形式的重组疫苗的作用是允许抗原加工的操纵，例如通过插入顺序的选择和遍在蛋白质（ubiquitination）加强及多表位基因产生过程的加工[42,43]。现在明白，复合表位疫苗的设计需要表位方面丰富的知识，但是它提供了一个好的控制T细胞表位及T细胞诱导的指令（repertoire）。另外，疫苗中的表位顺序很容易被修饰以充分利用MHC限制性（MHC-binding）和/或免疫源性[10,44]。
整个抗原疫苗
复合表位的一个缺点是比较危险，例如疫苗上重要表位的缺失，因为这些表位迄今为止还被忽视。足够表位知识的缺乏，使组成疫苗和编码整个肿瘤抗原有一个正确的选择余地。作为对照，多表位疫苗计划离开“自然”而决定其表位由宿主APCs呈递。整个抗原疫苗的优点是：他们的principleharbor不仅有整个CTL表位，而且还有整个TH细胞表位，而且他们的应用不受病人HLA型别的限制。希望整个抗原疫苗能很快的作为“off-the-shelf”形式被应用，这种形式在选择肿瘤相关抗原时不被正常组织表达，比如病毒（viral）和睾丸癌抗原，对suBDominant和隐蔽表位的免疫需要减少。蛋白中有害物质能通过这些抗原的突变解毒而排泄出去，如HPVE6/E7联合蛋白缺少转化的能力[11]。最后，包含肿瘤相关自身抗原的整个抗原疫苗异种形式导致的免疫，在包含同基因抗原相似疫苗时失败[20,45]。
癌症疫苗设计的额外部分是在这篇评论之外的，那就是抗原的呈递模式。这些因素包括分子限定和细胞基础佐剂，炎症因子，调整APC的药物和通过TNF感受体家族表面蛋白的T细胞感应，DNA的选择和病毒基础疫苗带有者（在别处曾有广泛的评论）[4]。
疫苗导致T细胞免疫的正确评价
迄今为止，病人出现疫苗引起的应答和临床应答相联合的还是缺乏的。在这些研究里对接种实验的免疫评价方法有了清楚的规划。在当前的文献和我们自己实验里有效数据的基础上，我们提出疫苗引起抗肿瘤免疫的测试方法，详述如下。
CTL应答的测试
特异性CTL免疫在试管内测试结果，IFN-γELISPOT测试包含了潜伏的主要PBMCs的一个或多个最小肽表位，其结果是灵敏的，可信赖的[23,24,46]。多表位疫苗靶肽的选择在ELISPOT测试中是被支持的，而整个抗原疫苗包含了大量的肽，例如，被利用的所有预测的表位或一套完整的重叠的肽[47]。自体移植细胞（单核白细胞系）由带菌者（viralvectors）感染，编码interest抗原或control抗原作为独特刺激细胞服务。在这里应答比较弱，在试管里单一刺激被考虑在内[48,49]。
监视选择肽的CTL免疫，用HLA-四聚体染色由荧光活性细胞（FACS）组成一个elegantadditionapproach。在急性应答或慢性感染者新鲜PBMC的样品中很快发现了CTL，能识别MART-1/26-35表位。HLA-A0201独特的表位CTL上出现频率很高，原因不知[46]。最近两篇报道也证实，gp-100和特异酪氨酸酶CTL在黑色素瘤患者新鲜PBMCs中发现。然而，在其他大多数的病例中，试管中四聚体细胞清除检查需要瞬间刺激[49,51-53]。在引流淋巴结中测试的淋巴细胞比在外周血中的结果要高[54,55]。
四聚体在实验抗原和自然T细胞中都发现了，而在ELISPOT测试中仅测到了记忆和效应器细胞[46,56,57]。因此，ELISPOT是一个专门辨别比较疫苗导致T细胞和幼稚及无活性T细胞的技术。四聚体的染色与试管中由IFN-R产生引起的CTL的染色相同[10,50]。
四聚物染色（Tetramer-staining）一个新的有趣的应用最近出现了：用特异性肽CTL，在淋巴和非淋巴样器官中进行探测[58]。接下来的研究将要揭示这一技术是否可行，相应的工作在鼠身上已显示可以用特异性抗原T细胞在癌症病人的淋巴结引流和活检中进行探测，这就提供了一个更好的发展方向：肿瘤特异性抗原T细胞和癌症患者的APCs之间的相互作用。
TH细胞应答的测试
对免疫中抗原特异性TH细胞的评价，正如IFN-γ和IL-4（分别测TH1和TH2免疫）ELISPOT方法短期扩散（激增）方法是比较好的[32,33]。在这些实验中，成熟抗原和幼稚T细胞释放的细胞因子可以区别开分别进行检测。依靠这些接种模型，选择短肽或一套重叠的长肽来覆盖整个感兴趣（interest）抗原（尽管昂贵）已经完成了。此外，区别低亲和力特异肽T细胞和那些能识别的自然加工抗原的生理（数量）是必不可少的。通过对APCs重组蛋白反应的测试说明interest抗原和对照（control）抗原可由同一方式产生[32]。MHC-Ⅱ类四聚体最近能被利用[59]，试管内产生的T细胞也通过细胞内对细胞因子染色被分解，这就保证了反应T细胞属于CD4+T细胞系列。
带菌者（vector）应答和体液应答的测试
上述方法的焦点在于试管中测试的对肿瘤interest抗原的T细胞免疫应答。在应用病毒进行接种的病例中，对这些病毒的应答也能被监视，这就表明疫苗是有效的。而且，在人体内对抗原免疫和迟发型过敏应答的测试也显示是大大有益的[1,33]。
最后，我们应该强调的是，抗肿瘤体液应答是重要且相对容易的，特别是在整个抗原疫苗。实际上，在鼠和临床研究中肿瘤抗原特异性免疫球蛋白应答包含了很多抗肿瘤应答[5,45,60,61]。
在所有的病例中，免疫的评价应包括相同的健康人或安慰剂对照组的测试，对每一个测试背景进行评价，保证发现的应答真正的与疾病和/或预防养生之道相联系[46]。
结论
下一代特异性抗原癌症疫苗可能发展适用于小进展阶段疾病病人的疫苗，和对自然和疫苗导致的免疫进行有效和准确的评价，意思就是癌症的免疫治疗将到来。在接下来的临床实验中将会肯定特异性抗原疫苗在病人中产生的强大T细胞免疫的能力，和与疫苗导致的免疫相关的真正治疗效果在结果中的增多。
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