PCRSSP检测人类白细胞抗原(HLA)B27表达水平的研究 实验方法 丁 ...
一、摘要
目的利用聚合酶链反应（PCR）进行HLA-B27的测定，探讨HLA-B27水平，正确评价HLA-B27的临床意义方法应用PCR技术进行人外周血白细胞的HLA-B27检测。结果采用该方法对各组病人外周血HLA-B27测定。结果表明:正常对照组，健康人70例，B27阳性3例，阳性率4.2%，48例原因不明的腰腿痛病人中B27阳性11例，阳性率22.8%，本组临床拟诊强直性脊柱炎（AS）患者70例，阳性58例，阳性率82.8%。本组6例混合性脊椎炎患者B27全阳性。结论从实验结果来看，AS患者携带率明显高于正常人（P<0.05），揭示HLA-B27等位基因与AS的发生呈强相关。该基因的检测对AS的诊断有定的参考价值，对于临床诊断与鉴别诊断AS的发生有重要的帮助。
HLA-B27抗原为HLAI类抗原，存在于所有核细胞和红细胞表面，能刺激产生同抗体并控制细胞毒T效应细胞的特异性。HLA位点具有众的等位基因，造成HLA的极端多态性。它代表一家族包括几个紧密相关的等位基因（B2701-11）都具有密码子AAG、编码赖氨酸70（LYS）。近年来，由于分子生物学的进步，人们对B27包括其亚型的分子结构、种群分布以及B27亚型与AS的关系有深一步的认识。资料表明95%的AS患者具有HLA-B27抗源，具有HLA-B27抗源者其患AS的几率为7.3%。因而，HLA-B27测定成为临床AS诊断与鉴别诊断的主要手段。本文拟建立一种PCR-SSP分子生物学检测技术，探讨HLA-B27的表达水平。我们对门诊骨科及住院骨科、内分泌科共124例患者，利用PCR-SSP技术，进行HLA-B27检测，现报告如下。
二、材料与方法
1. 方法
（1）DNA的提取检测取上述已抗凝混合匀的血液标本500μl放进1.5ml反应试管中，加700μl的ELB溶液，然后混合均匀（用吸管反复吸挤）。用低渗溶血法分离白细胞，再用高氯酸盐沉淀法提取外用白细胞DNA。分离出的DNA可以被溶解于水或DNA溶液缓冲液（如TE缓冲液），整个提取过程约需45~60min，主要取决于样本量的多少。DNA能在2℃~8℃条件下贮存几个月，在-20℃条件下，储存更长时间。
（2）PCR扩增反应体系（13μl），Pel-Freez标准PCRBuffer6μl;特异性引物5μl，TaqDNA聚合酶0.08μl，ddH2O1.02μl，模板DNA0.9μl。PCR扩增96℃预变性1min，然后96℃25s，70℃50s，72℃45s，进行30个循环周期，整个循环需65min，Hold4℃，扩增110min，取13μl扩增产物加2μl上样缓冲液置2%琼脂糖凝胶上电泳。
2. 统计学方法采用SPSS统计软件对结果进行χ2检验。
三、讨论
实验所用B27试剂盒包括3个反应孔，其中2个为特异性反应孔（1、2号管），另一个为污染监控孔3号管，两个特异性反应孔引物编号分别为PM138B（1号管）和PM053B（2号管）。
PM138B孔的阳性产物大小约为600bp左右;PM053B孔的阳性产物可能出现2条带，一条大小约为600bp左右，另一条大小为200bp左右。
只要出现一条阳性带即可判断此孔为阳性反应孔，两个特异性反应孔均为阳性，而污染盐护孔阴性者，即可判断其B27型。本文AS患者58例出现260bp的扩增条带，片段大小与设计的目的基因片段相同，为B27阳性结果，阳性率达82.8%，与文献报道一致。
混合性脊椎炎是一种以强直性脊椎炎伴有四肢关节炎的疾病，本文6例HLA-B27全为阳性，对临床诊断与鉴别诊断意义很大。对照组70例3例HLA-B27阳性，阳性率4.2%，与中国人HLA-B27频率为3.4%一致，强直性脊椎炎发病率为0.26%，具有HLA-B27抗原者其患AS的几率为7.3%，该基因的检测与AS的诊断有一定的诊断价值。
PM138B孔的阳性产物大小约为600bp左右;PM053B孔的阳性产物可能出现2条带，一条大小约为600bp左右，另一条大小为200bp左右。
只要出现一条阳性带即可判断此孔为阳性反应孔，两个特异性反应孔均为阳性，而污染盐护孔阴性者，即可判断其B27型。本文AS患者58例出现260bp的扩增条带，片段大小与设计的目的基因片段相同，为B27阳性结果，阳性率达82.8%，与文献报道一致。
混合性脊椎炎是一种以强直性脊椎炎伴有四肢关节炎的疾病，本文6例HLA-B27全为阳性，对临床诊断与鉴别诊断意义很大。对照组70例3例HLA-B27阳性，阳性率4.2%，与中国人HLA-B27频率为3.4%一致，强直性脊椎炎发病率为0.26%，具有HLA-B27抗原者其患AS的几率为7.3%，该基因的检测与AS的诊断有一定的诊断价值。
HLA-B引物混合物含有扩增1069bp片段的编码，人生长因子的对照引物。些引物的浓度大约是特性等位基因引物对的1/5，目的是为成功的PCR扩增反应提供一个内部对照，这种扩增常发生。
例如：在特性等位基因或基因组PCR片段存在或缺失的情况下发生扩增反应。因此，在PCR反应中一般能看到对照带。偶而在特性等位基因HLA-BPCR产物存在下，对照组出现或消失，这不是局限性，因为特定的带为成功PCR程序提供检查。被PCR拟制剂污染的DNA，诸如血红蛋白、肝素、乙醇等能严重干扰PCR反应，因此，肝素不应作为DNA分离原料，因使用EDTA或柠檬酸抗凝。
强直性脊柱炎是当一种常见病、多发病，以侵犯骶骨关节、脊柱等活动较差的大关节为主，致残率高。过去一致把AS病与类风湿关节炎（RA）相混肴，或称为"类风湿关节中枢型"；误诊率高达60%，X线检查只能提示AS病的中晚期炎症改变，难以确定炎症性质，因而延误治疗时机。对AS病早期确诊，及时治疗至关重要，使远期预后良好。所以，对有上述症状患者作HLA-B27检测可早诊断、早治疗，以免致残。根据BERRETTONT公式可计算出带来有B27抗原与不带有B27抗原时诊断AS的概率。
例如：在特性等位基因或基因组PCR片段存在或缺失的情况下发生扩增反应。因此，在PCR反应中一般能看到对照带。偶而在特性等位基因HLA-BPCR产物存在下，对照组出现或消失，这不是局限性，因为特定的带为成功PCR程序提供检查。被PCR拟制剂污染的DNA，诸如血红蛋白、肝素、乙醇等能严重干扰PCR反应，因此，肝素不应作为DNA分离原料，因使用EDTA或柠檬酸抗凝。
强直性脊柱炎是当一种常见病、多发病，以侵犯骶骨关节、脊柱等活动较差的大关节为主，致残率高。过去一致把AS病与类风湿关节炎（RA）相混肴，或称为"类风湿关节中枢型"；误诊率高达60%，X线检查只能提示AS病的中晚期炎症改变，难以确定炎症性质，因而延误治疗时机。对AS病早期确诊，及时治疗至关重要，使远期预后良好。所以，对有上述症状患者作HLA-B27检测可早诊断、早治疗，以免致残。根据BERRETTONT公式可计算出带来有B27抗原与不带有B27抗原时诊断AS的概率。
编辑：赵栋2012
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发布于 ： 2019-02-21
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