【求助】原核表达的蛋白作抗原制备的血清是否有缺陷
2005-10-24
问题描述：
我采用原核表达的植物病毒衣壳蛋白,经SDS-PAGE切胶纯化的方法提取纯的蛋白(经电泳验证纯度)作为抗原,免疫家兔,制备出了较高效价的抗血清,该效价测定是用表达的提纯蛋白作抗原测定的,并且通过westernblot的方法验证可与感病植物中的病毒反应,但是有较弱的非特异反应,但是当我用血清来用dasELISA的方法来检测植物中的自然状态的病毒是,阴阳性对照的od值接近,用dotblot的方法得到几乎相同的结果,并且我是用三个人(我,师姐,我的一位老师)用同一种方法制备的血清,时间不同,并且我的那个老师是在中国农业大学一个国家重点实验室作的,因此我怀疑用这种策略制备抗血清本身是有缺陷的,以下是我的观点:
(1)原核表达的蛋白在空间构象上与在真核细胞是有区别的,缺乏一些特定的胞内折叠机制
(2)sds-page切胶回收的蛋白实际上是一个线形化的结构,缺乏正确的自然状态下的二三级结构,因此用它制备的血清所能结合的自然状态的病毒蛋白抗原决定簇有差异,最后表现在检测植物体内病毒时的非特异反应很强
(3)westernblot之所以能够检测是因为杂交到膜上的蛋白也是经过变性后成为线性化结构
不知道我这样说是不是有道理,我只是觉得如果三份这样的血清都出现这样的问题,应该不是检测方法操作的问题,而是血清本身有缺陷,虽然也有关于用这种方法制备血清并成功检测的报道.但是我想这与不同的病毒本身的性质有关.
望各位给予指点
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hanshen_1234
用户
没有人回复吗,求求各位给点建议
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asura1981
用户我觉得楼主已经比较好的解决了自己的问题，文献报道成功的例子可能表位就在线性上，楼主的病毒可能是构像表位，建议选取非变性的表达蛋白纯化。原核表达和真核表达有一定区别，但在这里，应该作第二原因考虑。
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