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实验需要请问有没有养THP-1细胞的同仁?能否寄一皿我,我在广州南方医科大学,不胜感激!
做细胞实验快半年了,一直都还挺顺的,这次五一放完假回来,复苏一支HK2,操作都跟以前一样,没想到出了好多问题:
冻存方法:包裹棉花直接-80℃过夜,第二天转移到液氮
冻存时间:1个半月前冻存的细胞,密度保证没问题,冻存前状态也好
复苏方法:液氮取出后37℃水浴,约2分钟溶解,加入6倍体积的完全培养基,800转离心5分钟,弃去上清,1ml完全培养基重悬,转移入培养皿(进口一次性塑料培养大皿),补足完全培养基,培养箱培养
第二天看细胞全都没贴壁,但是也没死,聚集成团装飘着,没有污染。不想重新离心加重机械损伤,就一直试试看的心态放在培养箱里养着了。又重新复苏一支,还是一样的结果,全飘着没贴壁。不死心,就往前面复苏的那一皿里直接加了1ml的血清,相当于18%的血清比例,过了一天去看,这下细胞都贴壁了。没有另外添加血清的那一皿就还是没贴壁。
另外还有一支以前复苏的HK2,也是一样的方法复苏的,那次复苏很好,细胞基本没什么死的,也都贴壁了,养在皿里状态也不错,但是拿来铺板就还是不贴壁,同样的培基(10%血清),铺板就一个不贴,皿里就都可以贴上。
求助各位战友:
1、复苏不贴壁是为什么?
2、增加血清比例能使复苏的细胞贴壁,这样的细胞是不是可以认为状态并不好,以后的培养是不是要一直这么高比例的血清?还是可以培养一段时间逐步减少血清比例?
3、仍然是10%血清,为什么铺板就不贴壁,而皿里的就没事?是不是铺板的时候也要增加血清比例呢?那在板里干预的过程中是不是要一直保持高比例的血清培养?
4、我的冻存及复苏方法是否有错?我觉得我的HK2从形态、生长速度上来说状态应该是不错的,而且我已经更换了全新的培基、血清和双抗,重新配置了完全培养基,不知道为什么会出现这种不贴壁的问题
拜托各位集思广益,细胞实验已经为了这个不贴壁的问题停滞快2周,心急如焚啊,拜托各位!
小弟现有一事儿想求助!
如下:1)凋亡的时候细胞色素c由线粒体里释放到胞浆里去的。那么如果能够测到此时在胞浆里的细胞色素c表达增多的话应该就能说明问题了
(2)可此时的问题是如果提胞浆蛋白时把线粒体也裂解了话细胞色素c也会被释放出来,还是会在胞浆里大量表达!就说不清楚是凋亡由线粒体释放的还是被人为的破坏了线粒体导致了的!!!
(3)故我的问题就是该怎么样去除这个人为的影响?怎么说明我测的胞浆里的细胞色素c就是凋亡时线粒体释放的?换句话讲就是如果能够在用细胞裂解液裂解胞浆蛋白时,将线粒体剔除掉?
是不是买个细胞色素c的测试盒就可以了啊?这个盒子有人用过吗,请指教一二!
盼复!非常感谢!
我们产品注册的时候在安全性说明上标明了该仪器由专业人员操作,所以不考虑这条。但是药监局老师说应该考虑。请教各位,这个如果考虑的话,该怎么进行符合性证明?如果可以不考虑的话,请问有什么法规或文件支持?
四字原则:吸 擦 调 放
吸:用吸耳球吸取液体,四指拿移液管,食指扣于移液管上口。
擦:吸取后用滤纸擦干管壁。
调:放松食指使液体流出,调至刻度线,按紧。
放:沿器壁放入所需容器。
垂直是为了保证最后只剩下半滴时,移液管不计算在内的体积。如果移液管上没有写“吹”字,那么最后半滴可以不要。
移液管
用来准确移取一定体积的溶液的量器。移液管是一种量出式仪器,只用来测量它所放出溶液的体积。它是一根中间有一膨大部分的细长玻璃管。其下端为尖嘴状,上端管颈处刻有一条标线,是所移取的准确体积的标志。

