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제품특징
□ 특징
● Staphylococcus aureus 유래의 SaCas9를 이용한 One vector CRISPR/SaCas9 System
● Adeno-associated virus (AAV)를 이용하여 SaCas9과 sgRNA를 세포 내 도입
● Transfection이 어려운 Mammlian cell (분열, 비분열세포)에서 Genome Editing
● AAV에 의한 Cas9 도입은 genome integration을 억제하고 Cas9의 발현을 지속시킬 뿐만 아니라, off-target effect를억제
□ 제품설명
AAVpro®CRISPR/SaCas9 Helper Free System은 single guide RNA (sgRNA)와 SaCas9 (from Staphylococcusaureus) 유전자를 발현하는 Adeno-associated virus 2 (AAV2)particles를 Helper virus 없이 제작 가능한 제품이다. 본 제품은 S.aureus 유래의 SaCas9과 sgRNA를 하나의 벡터에서 발현할 수 있는 single vectorsystem이다 (그림 1). S.aureus 유래의 SaCas9nuclease의 유전자 크기는 3.3 kb로써, 기존에사용되어왔던 Streptococcus pyogenes 유래의 SpCas9 nuclease (4.1 kb) (보통 Cas9이라고명명함) 보다 약 1 kb 정도 작다. 그렇기 때문에 하나의 AAV vector에 sgRNA 발현 유전자와 SpCas9 발현 유전자를 한꺼번에 삽입이가능하게 되었으며, 이는 in vitro 및 in vivo에서 다양한 세포에서 효율적으로 Genome editing이 가능하다. 반면, SaCas9의 경우 SpCas9과PAM 서열 (Proto-Spacer Adjacent Motif) 및 target sequence의 길이 (20 - 22 nt)가 다르므로 sgRNA 디자인 단계를 고려할 필요가 있다 (그림 2). 본 제품에 포함되어 있는 SaCas9/sgRNA 발현 AAV vector, AAV packaging에 필요한 pRC2-mi342vector 및 pHelper vector를 HEK293T 세포주에 도입을 하면, Helper virus 없이고순도 및 높은 Titer의 AAV particle을 얻을수 있다. 본 제품에는 AAV production 및 CRISPR Genome editing을 위한모든 제품 (Ligationmix, Stellar™ Competent cells, AAV Extraction buffer 등)이 포함 되어있다.그림 1. pAAV-Guide-it-1 vector의 SaCas9과 sgRNA 발현 pAAV-Guide-it-1vector를 패키징하고 있는 AAVparticle을 Target cell line에transduction함으로써, SaCas9 단백질과sgRNA 유전자가 동시에 함께 발현된다. 그림 2. SaCas9의PAM sequence SaCas9의 PAM 서열은NNGRR (N=A, T, G, C / R=A/T)이며, PAM으로부터 3 - 4 bp의 염기를 절단한다. 또한, sgRNA의 Target sequence는 20 - 22nt를 권장한다.그림 3. AAV를 이용한SaCas9과 SpCas9의 Genome editing 효율비교 CYP2 Exon1 유전자 중, 2개의 다른배열을 editing 표적으로 하여 Two vector system인 AAVpro®CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2) (Code 632608)과 Sinlge vector system인 AAVpro® CRISPR/SaCas9Helper Free System (AAV2) (Code 632619)를 사용하여 AAVmediated CRISRP/Cas9 editing을 수행하였다. 12-well plate에 1 x 105개의 세포를 seeding, overnight 배양 후, SpCas9 or SaCas9 virus vector를 1 x 105 MOI로 감염시켰다. 72시간 후, 세포를 회수하고 Genome DNA 변이도입 효율을 Guide-it™ Mutation Detection Kit (Code 631443)을 사용하여 분석 및 비교하였다.
□ Applications
AAV-based delivery of a user-defined sgRNA and Cas9 for mammalian genome editing using CRISPR/Cas9 technology
□ 구성품
AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2) (Cat. No. 632619)
● AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector Set
● Guide-it™ Ligation Components
● Stellar™ Competent Cells
● pRC2-mi342 Vector
● pHelper Vector
● AAVpro® Extraction Solution
AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector System (Cat. No. 632618)
● AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector Set
● Guide-it™ Ligation Components
● Stellar™ Competent Cells
□ 보존
Stellar™ Competent Cells: -80 ℃기타: -20 ℃(AAVpro® Extraction Solution은 융해 후, 실온 보관)
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2、吸液:用右手的拇指和中指捏住移液管的上端,将管的下口插入欲吸取的溶液中,插入
不要太浅或太深,一般为10~20mm处,太浅会产生吸空,把溶液吸到洗耳球内弄脏溶液,
太深又会在管外沾附溶液过多。左手拿洗耳球,接在管的上口把溶液慢慢吸入,先吸入该管 容量的1/3
左右,用右手的食指按住管口,取出,横持,并转动管子使溶液接触到刻度以上 部位,以置换内壁的水分,然后将溶液从管的下口放出并弃去,如此用反复洗3
次后,即可 吸取溶液至刻度以上,立即用右手的食指按住管口。 3、调节液面:将移液管向上提升离开液面,管的末端仍靠在盛溶液器皿的内壁上,管身保
持直立,略为放松食指(有时可微微转动吸管)使管内溶液慢慢从下口流出,直至溶液的弯
月面底部与标线相切为止,立即用食指压紧管口。将尖端的液滴靠壁去掉,移出移液管,插 入承接溶液的器皿中。
4、放出溶液:承接溶液的器皿如是锥形瓶,应使锥形瓶倾斜30°,移液管直立,管下端紧
靠锥形瓶内壁,稍松开食指,让溶液沿瓶壁慢慢流下,流完后管尖端接触瓶内壁约15 秒后,
再将移液管移去,残留在管末端的少量溶液,不可用外力强使其流出,因较准时已考虑了末 端保留的溶液的体积。
它最初由在德国生物学家罗伯特·科赫手下工作的细菌学家朱利斯·理查德·佩特里(1852-1921)于1887年设计,故又称为“佩特里皿”。
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其实就是常见的圆形的上下盖培养皿,你可以看看它的英文,就叫做petri dish,直译过来就叫做——佩特里小碟子——也就是皮氏培养皿
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第二,三段为原创手打……第一段为摘抄
准确的分析方法对于生物化学实验是极为重要的,在各种生物化学分析技术中,首先要熟练掌握的就是准确的移液技术。为此要用到各种形式的移液管,其中有一些是学生们在化学实验中未用过而在生化实验中是常用的。
1 滴管
使用方便,可用于半定量移液,其移液量为1mL~5mL,常用2mL,可换不同大小的滴头。滴管有长、短两种,新出的一种带刻度和缓冲泡的滴管,可以比普通滴管更准确地移液,并防止液体吸入滴头。
2 移液管(吸管)
吸管使用前应洗至内壁不挂水珠,1mL 以上的吸管用吸管专用刷刷洗,0.1mL、0.2mL 和0.5mL的吸管可用洗涤剂浸泡,必要时可以用超声清洗器清洗。由于铬酸洗液致癌,应尽量避免使用。若有大量成批的吸管洗后冲洗,可使用冲洗桶,将吸管尖端向上置于桶内,用自来水多次冲洗后再用蒸馏水或无离子水冲洗。
吸管分为两种,一种是无分度的,称为大肚吸管,精确度较高,其相对误差A 级为0.7%~0.8%,B 级为1.5%~0.16%,液体自标线流至口端(留有残液),A 级等待15s,B 级等待3s。另一种吸管为分度吸管,管身为一粗细均匀的玻璃管,上面均匀刻有表示容积的分度线,其准确度低于胖肚吸管,相对误差A 级为0.8%~0.2%,B 级为1.6%~0.4%,A 级、B 级在吸管身上有A、B 字样,有”快”字则为快流式,有”吹”字则为吹出式,无”吹”字的吸管不可将管尖的残留液吹出。吸、放溶液前要用吸水纸擦拭管尖。
3 微量进样器
微量进样器常用作气相和液相色谱仪的进样器,在生化实验中主要是用作电泳实验的加样器,通
常可分为无存液和有存液两种。
(1)10μL 以下的极微量液体进样。
无存液微量进样器:进样器的不锈钢芯子直接通到针尖端处,不会出现存液。
(2)10μL~100μL 有存液微量进样器:不锈钢的针尖管部分是空管,进样器的柱塞不能到达,因而管内会存有空气或液体,其使用注意事项是:①不可吸取浓碱溶液,以免腐蚀玻璃和不锈钢零件;②因为有存液,所以吸液时要来回多拉几次,将针尖管内的气泡全部排尽;③针尖管内孔极小,使用后尤其是吸取过蛋白质溶液后,必须立即清洗针尖管,防止堵塞。若遇针尖管堵塞,不可用火烧,只能用φ0.1mm 的不锈钢丝耐心串通;④进样器未润湿时不可来回干拉芯子,以免磨损而漏气;⑤若进样器内发黑,有不锈钢氧化物,可用芯子蘸少量肥皂水,来回拉几次即可除之。(更多质量检测、分析测试、化学计量、标准物质相关技术资料请参考中检所对照品查询 www.rmhot.com)
4 自动取液器
这种取液器在生化实验中大量地使用,它们主要用于多次重复的快速定量移液,可以只用一只手操作,十分方便。移液的准确度(即容量误差)为±(0.5%~1.5%),移液的精密度(即重复性误差)更小些,为≤0.5%。
取液器可分为二种:一种是固定容量的,常用的有100μ L 等多种规格。每种取液器都有其专用的聚丙烯塑料吸头,吸头通常是一次性使用,当然也可以超声清洗后重复使用,而且此种吸头还可以进行120℃高压灭菌;另一种是可调容量的取液器,常用的有200μL、 500μL 和1000μL 等几种。
可调式自动取液器的操作方法是用拇指和食指旋转取液器上部的旋钮,使数字窗口出现所需容量体积的数字,在取液器下端插上一个塑料吸头,并旋紧以保证气密,然后四指并拢握住取液器上部,用拇指按住柱塞杆顶端的按钮,向下按到第一停点,将取液器的吸头插入待取的溶液中,缓慢松开按钮,吸上液体,并停留1~2秒钟(粘性大的溶液可加长停留时间),将吸头沿器壁滑出容器,用吸水纸擦去吸头表面可能附着的液体,排液时吸头接触倾斜的器壁,先将按钮按到第一停点,停留一秒钟(粘性大的液体要加长停留时间),再按压到第二停点,吹出吸头尖部的剩余溶液,如果不便于用手取下吸头,可按下除吸头推杆,将吸头推入废物缸。
自动取液器的使用注意事项是:
①吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指,绝不允许突然松开,以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。
②为获得较高的精度,吸头需预先吸取一次样品溶液,然后再正式移液,因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时,吸头内壁会残留一层”液膜”,造成排液量偏小而产生误差。
③浓度和粘度大的液体,会产生误差,为消除其误差的补偿量,可由试验确定,补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。
④可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法,来校正取液器,1mL 蒸馏水20℃时重0.9982g。
大家做溶出曲线稀释溶液时有某有再用移液枪?移液枪量取1ml的体积准确不?
以前先放-80再液氮,但是去-80冰箱有点远,我想能不能直接放液氮里面,我直接放过复苏成活率低了很多,有没有这种冻存盒可以直接放液氮的?