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基因解码技术

二代测序技术给生命科学领域带来了彻底的改变，而NGS领域本身也在经历着某种意义上的变革。本文对二代测序领域的最新进展做了小结，其涉及的公司包括454LifeSciences,Illumina,LifeTechnologies,PacificBiosciences,OxfordNanopore等。

自从哈佛大学遗传学家GeorgeChurch和454LifeSciences公司JonathanRothberg掀起二代测序NGS的**以来，已经过去了将近十年。毫不夸张地说，这段时间以来NGS技术已经发生了翻天覆地的变化，在测序通量突飞猛进的同时，测序成本直线下降。
想当年454LifeSciences公司测序580-kb的细菌基因组，需要四小时的工作循环。而今年一月份Illumina公司发布的HiSeqX?Ten测序系统，能够以千元成本测序完整的人类基因组，最多每天能测序600billionbp。
如今，二代测序技术给生命科学领域带来了彻底的改变。而NGS领域本身也在经历着某种意义上的变革。正因如此，基因组学ArchonX奖（ArchonGenomicsXPrize）不得不于去年八月宣布取消，因为测序成本的直线下降已经使竞赛变得毫无意义。
Church的团队是该竞赛仅有的两只报名队伍之一，他认为参赛者们是否能够完成竞赛任务还很难预料。但无论如何，既然竞赛已经启动，总得让人家比完吧。
言归正传，二代测序领域的2013年既忙碌又喧嚣，在开年之际让我们对这一领域发生的最新进展做个小结吧。
454LifeSciences
去年十月，454LifeSciences宣布将于2016年中旬逐步淘汰其焦磷酸测序仪器，GSJunior和GSFLX+。据该公司介绍，从扩展性和成本角度看，454平台作为首个商业化的NGS系统已经基本上走到尽头，很难再对其进行升级和改良。Roche的BethButton指出，公司正在寻求新的测序合作伙伴。2013年9月，该公司宣布与昔日的竞争对手PacificBiosciences合作，拟基于PacBio公司的SMRT技术进行诊断产品的开发。
Illumina
今年一月Illumina公司发布了两个以Solexa测序技术为基础的新测序平台，HiSeqXTen和NextSeq?500。
据该公司的新闻稿介绍，定价$250,000的台式NextSeq500兼具了样品制备和测序功能。“它按钮式的操作，可以在许多常见测序应用之间切换。该系统能够在一天内测序整个人类基因组和多达16个外显子组。”NextSeq500运行75个测序循环只需12小时。
HiSeqXTen系统以10台仪器为单位销售，据称可以实现千元成本的人类基因组测序。该系统现定价1000万美元，能够在三天时间内生成1.8terabases的数据，相当于每天约600Gb，比HiSeq2500强十倍。
华盛顿大学的ElaineMardis表示，HiSeqXTen系统针对的应该是提供人类基因组测序的服务产业，因为很少有研究机构能用到如此高的通量。“要想实现千元成本，就需要正确的样本量，”她说。当然，高通量还意味着更为复杂的数据分析。
Mardis的团队曾作过计算，为了跟上HiSeqXTen他们可能需要花费八百万美元在信息学设施上。此外，实现千元成本意味着每年需要测序18,000到20,000个基因组。“我要测序许多肿瘤基因组，”她说。“但数量还远远不够。”
LifeTechnologies
已被ThermoFisher收购的LifeTechnologies拥有两款NGS平台，SOLiD和IonTorrent。据Thermo的AndyFelton介绍，公司已经将工作的重心放在后者身上。“绝大多数研发工作已经转移到Ion上，”他说。
目前的IonPGM系统可使用最新的Ion318芯片，产出多达6million400bp的读取，也就是说四小时运行的产量能达到2Gb。而新IonProton?使用IonPI?芯片，能够产出80million200bp的读取，即每次运行产量达到10Gb至14Gb。
据介绍，今年公司将会推出用于转录组测序的新IonPII芯片，每张这样的芯片可产出300million100bp的读取，随着系统改良甚至可能达到200bp。
此外，LifeTechnologies公司正在研发一种新的聚合酶，Hi-Q。据Felton介绍，Hi-Q能“显著提高精确性”，减少90%的插入/缺失误差。这种酶将于今年的中旬实现全面商业化。
PacificBiosciences
PacificBiosciences公司以长读取的二代测序技术著称。据该公司的创始人SteveTurner介绍，在新测序化学P5-C3的帮助下，如今PacificBio的测序读长已经达到了8.5kb。P5-C3“提供了一个保护性的支架”，可以阻止酶和荧光团之间发生身体接触，避免酶受到潜在的光学损伤。
“我们已经很大程度上减少了系统中的光学损伤，我们相信现在测序读长受到的限制，只来自于样品本身，”Turner说。样品本身的限制是指，读长越长就越难生成不含损伤位点或缺口的测序模板，而这样的缺口会导致测序过早中止。
目前PacBio®RSII和SMRTCell系统，每次运行可产出50,000个读取（约400millionbp）。这一数字会在接下来的一年中继续增涨，Turner说。“我们预计在2014年内，令测序读长再增加50%，并于2015年达到20,000bp。”
最近研究人员发表文章向人们展示，在新装配方法HGAP的帮助下（hierarchicalgenome-assemblyprocess），可以实现只利用PacBio化学法对真核基因组进行从头装配。一月份，该公司公布了对黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）进行的完整二倍体基因组装配，生成了长达24.6Mb的重叠群（contigs），N50值为15.2Mb（N50值反映了重叠群的长度）。就在上周，PacBio公司又公布了一个54x覆盖度的单倍体人类基因组装配，生成了“3.25Gb的基因组装配，重叠群N50值为4.38Mb，其中最长的重叠群达到44Mb。”
OxfordNanopore
OxfordNanopore公司无疑是纳米孔测序的领导者，这一技术也被称为第三代测序。该公司去年十月份宣布，将在2014年年初推出USB大小的MinION?测序仪，为客户提供先期体验（early-access）。
与其他类似先期体验项目不同的是，OxfordNanopore公司不会局限于传统的测序中心，而是向广大的个人用户敞开大门。该公司准备在接下来的一周发出邀请。
OxfordNanopore公司强调，不是每个MinIONAccessProgram（MAP）申请者都会在第一轮受到邀请，而且公司提供的MinION数量也可能少于申请者的要求。这些仪器将在六周内进行发送。
2012年，OxfordNanopore公司在AGBT上描述了两个测序系统，MinION就是其中之一，另一个产品是GridION?。据公司发言人称，MinION的大小使其更容易受到人们的关注，它的灵活性和测序能力将推动NGS进一步迈向普罗大众。
OxfordNanopore公司希望通过MinIONAccessProgram评估测序系统的实用性、对不同应用的适应性、数据分析、以及公司的物流运输和试剂分配等。这些数据将有助于未来开展的GridION先期体验项目，不过该公司还未公布这一项目的具体启动时间。
广泛的应用前景
在二代测序技术不断进步的同时，它的应用也越来越广泛。据Mardis介绍，二代测序在临床领域的应用快速增涨。越来越多的研究者选择二代测序的多基因panel对肿瘤进行研究，或者通过外显子测序鉴定潜在的药物靶点。在诊断儿童遗传学疾病时，人们也逐渐抛开了传统的诊断方法，转而使用全外显子组测序。
Mardis补充到，NGS检测有两大优势，它既可以帮助人们确定治疗方案，也可以为患儿父母评估他们未来子女患同样疾病的风险。实际上Church认为，用二代测序进行（致病基因）携带者筛查，是NGS的“杀手锏”。
“任何考虑使用辅助生殖手段的人…都应当知道精子捐献者是否携带与严重疾病有关的隐性等位基因，”他说。“人们已经发现了数百个能够预测疾病的基因，现在也有不少服务可以对它们进行准确的检测。”
最近，Church作为共同作者发表了一项新研究。据他介绍，这是首次发表用NGS进行携带者筛查的文章，他们的方法“充分提高了质量并且降低了成本”。研究团队使用padlock探针，在194个细胞系中抽出并测序了15个有临床意义的基因，其中55个细胞系来自于携带上述基因突变的个体。
二代测序的另一个新兴的应用领域是单细胞RNA测序。“单细胞RNA测序能向我们展示，相同细胞中RNA表达的天然随机性，这一点非常吸引人。”Mardis说。
Church介绍到，他即将发表的一篇文章描述了一种新的测序方案，称为荧光原位测序（fluorescentinsitusequencing）。这一技术将荧光原位杂交和RNA-Seq结合起来，能够计数并确定不同转录本在组织切片中的空间定位。
Church的团队通过荧光原位测序证实，转录本会依据伤口的愈合情况在成纤维细胞中呈不对称分布。（Science禁止透露进一步的细节）
这样的数据在十年前简直难以想象。同样，我们也很难想象NGS在未来十年又会发生怎样的翻天覆地的变化。
来源：生物探索

求Illumina二代测序过程使用的酶，包括测序前样品准备过程和上机过程，越详细越好，最好是有相关的技术文档。

本人刚接触二代测序不久，因此对于测序定量这方面存在一些问题，希望大神们能帮助解一下，谢谢！！

我们使用的仪器是Illumina公司的nextseq500。在混样前会先进行荧光定量PCR（ABI7500），我一般是将文库稀释到4ng左右，稀释10000倍进行定量

1.同一批构建的同一种类型的文库，在定量时会有个别文库定量结果不准，复孔没问题（依据是我已将文库稀释到同样的ng数进行定量，所以得到的pm数应该在一个接近的范围内，但有的样本差异比较大），这种情况我一般会根据qubit定量将定量不准的个别样本参考其他样本的浓度进行稀释，下机数据量确实与校准的结果一致，说明应该是荧光定量的问题，这种情况在几种类型的文库中都有发生，文库一般在400bp左右。想问下这种情况是属于定量的问题还是文库自身的问题。

2.按照荧光定量的结果进行混样然后上机，每次我们混合后的文库都会进行qubit定量，大概会有一个上机参考值
（前提是不含有大片段的文库），但qubit值接近的文库上机的clusterdensity却相差很大，这是什么原因造成的？不同项目的文库会有影响，但我们文库的片段大小基本一致。有什么好的办法解决么？

3.最近按照荧光定量的浓度混合的文库上机，数据量总会超过预期很多，致使Q30很低，影响数据质量，采用的是7500机器，KAPA的定量试剂盒，机器才校准过，会不会是测序仪自身的问题？如果不是我们应该如何解决？

4.我们一般采用中通量测序盒子，大概每次上机在30个文库左右，数据量分配有时差别比较大（500M-8G），这样分配数据量可以完全按照荧光定量的结果分配么，数据量大的文库会不会成簇效率更高一些，使数据量小的文库得不到相应的数据量了？

5.除了2100和荧光定量这两种方法，还有什么其他的方法可以评价文库质量么？

6.现在上机文库得到的数据量有时与预期偏差较大，问题都在定量混合这块么？还有什么其他地方可能有问题么？

DNA测序的测序原理：
DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。
其原理是化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。
另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

利用DHPLC基因扫描技术进行深入彻底的突变与SNP筛查
StanLLilleberg
变性高效液相色谱（DHPLC）是一种新型遗传变异筛查技术，可用于单碱
基替换（或单核苷酸多态性），小片段缺失或插入等多种基因突变的检测。
DHPLC基因扫描技术可在生殖细胞系和体细胞系中筛查遗传变异。而像特定位
点DNA甲基化状态的改变等遗传现象也可用在DHPLC基础上建立的方法来检
测。遗传变异的生物学效应是由突变基因的位置和特点决定的，而功能相关基
因突变的发现对相关药物的研发有很大的促进作用。本文将对DHPLC技术在
突变检测领域的应用实例进行介绍和讨论；介绍的重点分别是致病基因突变位
点的确认，以及药物代谢和耐药性相关基因突变的检测。
关键词：候选基因，变性高效液相色谱，DNA甲基化，药物代谢，抗药性，
遗传变异，基因突变，遗传药理学，SNP筛查，SNP确认，体细胞变异。
缩略词
5-FU---5-氟尿嘧啶，AD---阿尔茨海默病，早老性痴呆，APP---淀粉样前体蛋白
AS---安格尔曼综合征，快乐木偶综合征，BWS---贝-威综合征，CF---囊性纤维
化，CHF---充血性心衰，CMT---沙-马-图病，进行性神经性（腓骨）肌萎缩，
COX-2---环氧合酶-2，CP---慢性胰腺炎，DHPLC---变性高效液相色谱，DPD---
二氢嘧啶脱氢酶，EOAD---早发性阿尔茨海默病，GIST---胃肠道基质瘤，
LOAD---迟发性阿尔茨海默病，HCM---肥大性心肌病，MLST---多位点序列分
型，PCR---聚合酶链氏反应，PWS---普-威综合征，SNP---单核苷酸多态性，
TPMT---硫代嘌呤-S-甲基转移酶，VEGF---血管内皮生长因子
介绍
当今的基因技术**已为医学和制药工业的发展开辟了新的途径。基因突
变和单核苷酸多态性（SNP）等DNA序列变异的确定正在成为新药研发的重要
组成部分[1]。而许多功能基因组，临床诊断和遗传药理学研究中的重大发现也
是通过检测基因突变和SNP实现的。分子遗传学的研究将对普通临床病症的分
子水平缺陷给予更好的解释，并最终促进针对这些缺陷的新疗法的产生。而遗
传变异研究在新药开发中最有意义的作用就是为药物治疗靶点的识别，描述和
确认提供信息支持[2]。
对一种可能的药物靶点进行遗传学分析可了解目的基因发生突变的程度。
对靶序列突变的分析描述是药物开发早期工作中的关键环节，它可为药物设计
提供最合适的突变靶点。而在药物靶点的确定过程中，遗传变异也可被用来证
明特定靶点与疾病表现型之间的关联。而特定靶基因突变与临床指征或标志之
间的正性关联将会对评估该药物靶点的临床相关性以及治疗价值提供强有力的
支持。这种遗传学分析通常在靶点确定过程的早期完成，为特定药物靶点的选
择提供证据支持。
遗传变异的分析在药物研发的后续过程中也有作用。例如在遗传药理学方
面，编码药物代谢酶类的基因发生突变等遗传因素可能影响受药个体对特定药
物的反应，进而影响该个体使用该药物的有效性和安全性[3]。遗传药理学的实
验数据可在药物研发和临床用药过程中起到辅助作用。此外，药物靶点本身以
及疾病相关基因的遗传变异也可对药物的治疗结果产生影响。这些遗传变异可
以成为有力的药效指标，也可以成为临床诊断和预后的标志物[4，5]。当深入
了解了各种疾病的遗传变异机理后，人们就可制定相应的治疗策略对这些疾病
进行正确的诊断和治疗了。
由上可知，遗传变异检测的作用不仅存在于药物靶点的识别和确定阶段，
而且贯穿于整个药物的研发过程中。因此，对编码特定药物靶点，疾病通道蛋
白，药物代谢酶类和耐药性相关蛋白的基因进行扫描，以便检测对药物疗效和
毒性有影响的SNP和基因突变是很有必要的。这些基因序列的改变有可能对其
表达的蛋白质的结构和（或）功能以及表达水平具有深远的影响。
理想的突变和SNP检测技术应当具有准确性和敏感性高，完全自动化，检
测成本低等特点。此外理想的检测技术在PCR反应引物的修饰，反应试剂的搭
配，检测标记以及PCR反应后处理等方面也应没有特殊的要求。变性高效液相
色谱（DHPLC），一种能够满足上述所有要求的新兴技术，已经逐渐发展成突
变检测的首选技术。DHPLC这种准确高效的基因筛查技术的发展，极大地促进
了新的突变位点的发现，并对了解疾病发生发展机制，确定药物研发方向做出
了重要贡献。本文将对近年来利用DHPLC技术确定基因序列突变的相关报道
进行介绍，并深入探讨这些发现的生物学意义。
利用DHPLC技术检测遗传变异
DHPLC技术可以通过温度调节的异源双链分析，自动检测单碱基替换，小
片段插入和缺失等基因序列的改变。关于DHPLC技术的工作原理和应用范围，
在Xiao和Oefner的综述[6]中有详尽的介绍。DHPLC基因突变筛查，就是利用
离子对反向液相色谱技术，通过独特的DNA分离基质，对特定的PCR反应产物
进行分离（图1）。在待测样品部分变性和乙晴冲洗梯度呈线性增加的情况下，
带有突变序列的异源双链，与同源双链(野生型或阴性对照)相比，它们的柱保
留时间相对较短。因此，带有突变序列的样品呈现出异源和同源双链混合物的
峰型特点，而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰型。出现与野生型或阴
性对照不同的DHPLC冲洗结果，说明检测样品含有突变序列。DHPLC技术为
确定带有突变序列的样品提供了一种简便而直观的途径，该种方法对生殖细胞
系和体细胞系的基因突变检测同样适用。
图一
图2展示了利用DHPLC技术检测DNA序列变异，以及通过测序技术确定
特定的碱基改变的过程。整个实验流程非常简便。首先从合适的来源分离DNA
和RNA，然后通过PCR或RT-PCR（模板为RNA）反应，扩增目的基因的特
定区域（即扩增子），扩增子一般包括一个外显子以及相应的外显子/内含子连接
区，
也有的扩增子包括启动子区域，或5’/3’非编码区域。在PCR反应之后，可直接
利用DHPLC技术对扩增子进行分析，无需再对PCR产物进行预处理。利用自
动化的DHPLC分离方法，目的扩增子可被彻底地扫描。最后如果DHPLC识别
出含有突变的扩增子，那么就要用测序的方法来确定其突变类型，DHPLC检测
结果没有改变的扩增子无需再进行测序。DHPLC突变检测技术的另一个优点是
可以收集异源双链部分。这些部分含有等量的野生型和突变型等位基因，可为
接下来利用测序方法确定突变类型提供便利。由于在测序前进行DHPLC筛查，
突变检测的总体效率和敏感性得到了大幅度的提高。本文将列举多篇利用
DHPLC技术对生殖细胞系和体细胞系进行突变检测的报道。更多的DHPLC相
关文献可在下面的两个网址中找到：http://www.transgenomic.com
http://insertion.standford.edu前者可通过目的基因和疾病来搜索DHPLC相关
文献，而后者是由Standford基因组技术中心（USA）提供的。
图二：
DHPLC突变检测技术的准确性
迄今为止，用于筛查疾病相关基因突变的方法有很多种。它们包括：单链
构象多态性（SSCP），构象敏感性凝胶电泳（CSGE），变性梯度凝胶电泳
（DGGE），双相基因扫描（TDGS），直接DNA测序，基因芯片分析技术等。
在过去几年中陆续有报道指出，DHPLC突变检测技术与其它方法相比，具有更
高的准确性和敏感性[6]。
最近有一项盲性研究，通过对BRCA1基因进行突变筛查，将DHPLC和其
它方法的准确性进行了比较[7]。结果只有DHPLC技术从65个样本中检测到了
全部58种突变，检测结果与测序结果完全相符。这58种突变包括38种单碱基
替换，16种碱基缺失，3种碱基插入和1种插入，缺失复合突变。这项研究证
明了DHPLC技术发现各种基因突变的能力。最重要的是这些突变中的40（71%）
种是以前从未被报道过的，有可能逃脱了其它基因分型诊断方法的检测。这项
研究结果为采用DHPLC技术作为分子诊断方法提供了有力的支持。在另外一
项对整个囊性纤维化（CF）基因（CFTR）的筛查中，DHPLC技术对73个CF
病人的全部CFTR突变的检出率为100%[8]。另外还有一些研究结果表明
DHPLC技术的突变检测准确率达到或接近100%。这些受检基因包括：X-连锁
眼白化病（OA1），威尔逊病（ATP7B），家族性腺瘤息肉病（APC），家族性癌
症综合征（PTEN,RET,VHL），常染色体显性多囊性肾病（PKD1,PKD2），血
友病A(因子Ⅷ)，家族性高胆固醇血症（LDLR），黑色素瘤（INK4A），和退行
性非综合征式遗传性耳聋（GJB2）等。表1中所罗列的是最近利用DHPLC筛
查突变的基因。Stanford基因组技术中心的网址
http://insertion.stanford.edu/dhplc_genes1.html,提供全部或部分利用DHPLC
筛查突变的基因列表，并提供相关疾病和引用文献的介绍。
DHPLC技术最适于对含有大量外显子的基因，以及多基因疾病相关基因进
行突变筛查。这些基因及其相关疾病的例子可在表1中找到，而更加全面的介
绍可在www.mutationdiscovery.com中找到。该网站对遗传突变研究者们免费
提供超过8600个人类基因的基因组DNA序列，以及在这些基因中已检测到的
突变信息。在这些信息基础上，该网站还提供用于筛查这些突变的PCR和
DHPLC的实验方案。
遗传异质性在很多复杂疾病中具有重要的意义，而DHPLC技术是研究遗
传异质性疾病相关基因突变的理想方法。一项关于沙-马-图病（进行性神经性腓
骨肌萎缩）（CMT）相关基因突变的研究报道是对上述观点的最完整的阐述[9]。
作者将利用DHPLC技术对168个CMT患者进行的基因（PMP22,MPZ,GJB1,
EGR2）筛查结果与直接测序的结果进行了比较。所有以前报道过的突变DHPLC
无一漏筛，而DHPLC检测出的某些新突变连测序技术都无法检测出。为了确
定这些新突变，作者通过收集DHPLC异源双链部分，加大了样品中突变等位
基因的含量，从而通过测序确定了突变类型。对于某些多表型疾病，如感觉神
经性耳聋，色素性视网膜炎和外周神经疾病等，DHPLC技术也是一种理想的方
法，因为它们都有大量的疾病相关位点需要进行基因突变筛查。
DHPLC突变检测技术的敏感性：
体细胞基因突变
直到不久以前，直接测序仍然被认为是突变检测的“金标准”。然而现在
基因突变频率低于20%就很难用测序方法检测到，这已是公认的事实[10]。
DHPLC技术是通过区分同源和异源双链来进行突变检测的。这种方法与直接
DNA测序相比更有利于突变等位基因的识别(图1)。已有文献报道DHPLC技术
可从待检样品中检测到占总基因量0.5-5%的突变等位基因，且实验重现性很好
[11，12，13，14]。近来有两篇报道表明DHPLC技术可从发生低水平体细胞遗
传镶嵌现象的结节状硬化患者标本中检测到TSC1和TSC2基因突变，而该种突
变用测序法完全检测不到[11，12]。更深入的研究表明这种基因突变存在于
6-15%的患者的外周血淋巴细胞中。
体细胞遗传镶嵌现象指的是在一个特定器官中出现具有不同遗传性状的多
个体细胞群落。这种现象可由DNA突变，DNA的修饰性改变，染色体异常或
自发性遗传突变逆转等因素引起。这种现象含有孟德尔式和非孟德尔式基因异
常，而它最典型的例子就存在于癌症的发生过程中。Youssoufian和Pyeritz在他
们的文章中对这种遗传镶嵌现象进行了详尽的总结[15]。漏筛这种遗传镶嵌现
象所造成的突变会导致基因突变发生频率的报告不准确，也会使遗传诊断发生
疏漏。而这种现象的筛查对检测肿瘤组织中的体细胞基因突变和异种组织线粒
体DNA中的致病基因突变也是非常重要的。近来有报道表明利用DHPLC技术
可从白血病患者P53基因的外显子中筛查出突变频率低于3%的基因突变[13]。
而在一项利用DHPLC技术对整个线粒体基因组进行突变筛查的研究中，频率
高于0.5%的突变都可被检出[14]。还有许多检测各种肿瘤癌基因突变的文献报
道也对DHPLC技术的敏感性给予了肯定，其中一些研究内容请见表2。
虽然肿瘤是一种遗传病这种观点早已是公认的事实，但特定的DNA遗传改
变和抗癌药物疗效之间存在关联才刚刚被认识到。未知突变的检测对于了解上
述的关联至关重要，而DHPLC正是实现这个目的合适的技术。例如在对肿瘤
发病机制的研究中，在新发现的基因中寻找突变非常重要。Lipkin在文章[16]
中报道利用DHPLC技术，发现一种新的DNA错配修复基因MLH3在25%的
受检结肠癌患者样品中发生了基因突变，而此前的两项利用其它敏感性和准确
性都较低的方法进行的研究都认为MLH3与结肠癌易感性无关。由此可见，
DHPLC技术的
敏感性和准确性确实拥有较大的优势。而Smith在他的文献[17]中报道了利用
DHPLC技术对已知和未知的疾病相关基因进行突变筛查的情况。在这项研究
中，DHPLC技术被用来筛查绝大部分APC和P53基因，因为突变有可能分散
在这些基因中。实验结果表明DHPLC技术作为一种基因突变预筛手段，可以
极大地提高测序的效率。
利用DHPLC技术分析DNA甲基化
DNA修饰性因素（如DNA甲基化等）在基因表达调控中的作用非常重要。
许多看家基因和超过40%的组织特异性基因在他们的启动子区域拥有CpG岛结
构，该结构很容易发生甲基化，从而对基因转录调控产生影响[18，19]。这些
CpG岛结构在发生DNA修饰后，对DNA编码的具体影响还有待证明；但DNA
甲基化与基因沉默之间的确存在关联，这一点可从大多数受测基因（约80%）
中得到证实[20]。而余下的20%受检基因在甲基化后表达水平增强，这些基因都
在第一个内含子或编码区域中含有CpG岛结构。
关于DNA修饰性因素参与癌症发生和发展的证据越来越多，而启动子甲基
化确实对许多肿瘤抑制基因的转录产生负性影响[21]。DNA修饰也与其它许多疾
病有关，例如BWS[22],PWS[23],AS[22]等综合征。环境因素对DNA甲基化有
直接的影响，例如维生素B12缺乏会引起叶酸代谢紊乱，以及DNA甲基化状态的
改变，而在肿瘤组织中维生素水平也会影响DNA甲基化状态[25]。因此检测CpG
岛甲基化对我们了解基因调控与疾病发生发展的关系非常重要。
了解特定疾病过程中甲基化状态的重要性极大地促进了精确描述和量化
DNA甲基化的实验方法的发展。一些常规的甲基化检测方法，如DNA测序，以及
其它基于凝胶和PCR技术的甲基化检测方法，都是费时费力，不适于进行大样
本实验。
而最近有些的报道表明利用DHPLC技术进行甲基化检测可以避免重蹈其它方法
的覆辙[26，27，28，29，30]。
Deng在他的文章[26]中介绍了一种PCR扩增亚硫酸盐修饰的CpG岛，然
后利用DHPLC技术同时检测扩增产物中的CpG岛甲基化和SNP的方法，并用这
种方法对多种细胞系和胃癌细胞系中hMLH1启动子，以及环氧化酶2（COX2）
启动子的甲基化状态进行了检测[26]。这种亚硫酸盐-DHPLC技术可对纯合与杂合
样本中的同源与异源CpG岛结构进行快速的甲基化和SNP检测和定量。这种方
法的另一个优点是在扩增片段中同时检测出CpG位点和SNP。两项相似的实验
都使用甲基化特异性PCR和DHPLC技术来分析三种人类印记基因的甲基化状态，
这三种基因分别是：AS和PWS相关的SNRPN基因，以及BWS相关的LIT1和H19
基因[27，28]。利用这项技术可以在患有PWS婴儿的样品中检测到低水平的细
胞镶嵌现象，这充分证明了该项技术的敏感性[27]。这种变异水平很低的细胞
系（血中低于8%）
用传统的分子生物学方法根本无法检测到。而这种检测低水平细胞镶嵌的能力
对于以遗传镶嵌作为部分显型表现的各种孟德尔和非孟德尔式遗传疾病的临床
诊断和预后有着重要的意义[15]。
另外一种基于DHPLC技术的方法也被用来检测特定位点的CpG岛甲基化
[29，30]。这种方法利用亚硫酸盐处理的基因组DNA的PCR产物，将单核苷酸
引物延伸与DHPLC分离技术相结合，来区分甲基化和非甲基化的CpG岛。而有
些CpG位点是在对引物延伸产物进行多链化之后再进行分析的。利用DHPLC技
术可对特定CpG位点的甲基化进行量化分析。而对于已经明确甲基化对基因调
控影响的特定序列，使用DHPLC技术对其进行分析是非常合适的。
DHPLC在SNP发现和确定研究中的应用
候选基因筛查
人类基因组中众多的DNA多态性以及SNP对基因功能的影响决定了深入
了解候选效应蛋白的遗传变异状况是非常必要的。在构建一个候选疾病基因的
遗传变异图谱时，首先用经典方法确定一个低分辨率的遗传位点，接下来再根
据参照样品（野生型）和各种受检样品建立一个高分辨率的SNP图谱[31]。为
了实现上述目标应该在目的基因区域确定SNP的位置和类型，这需要PCR扩增
基因组DNA,并进行测序分析。但是SNP的实质只是对功能相关研究很重要，
而并非是构建遗传图谱的关键。DHPLC突变筛查技术很好地适应了遗传变异研
究的这一特点，它只检测DNA序列差异，并不确定差异的实质。
利用DHPLC-SNP筛查技术来确定一个功能基因可以采取两种途径[32]。
第一种方法，收集大量的候选疾病基因的样品，然后利用DHPLC对可能发生
功能性SNP的编码序列进行筛查。这种方法的前提是与一种遗传病表现型相关
的基因中应有一个或多个疾病相关的突变位点，因此致病基因突变也应相对频
繁地出现在有相应的疾病表现型的样品中。而上述方法对筛查序列的限制也会
导致漏筛位于非编码调节区域的序列变异。在第二种相对全面的方法中，一个
基因的全基因组序列被系统地进行突变筛查。这样做的优点是在样本量充足的
情况下，漏筛功能性多态的几率较小。上述两种基于DHPLC的方法都能极大
程度上降低SNP筛查的工作量，进而对人类疾病相关遗传位点的构图产生重要
的影响。下面将简要介绍几篇利用DHPLC技术进行SNP筛查的文献报道。
充血性心衰
Lynch和他的同事们在文章[33]中表示充血性心衰（CHF）相关的G蛋白和
下游信号传导通路蛋白的遗传变异信息存在极大的缺陷。在这项研究中，他们
检测了编码信号传导蛋白的基因，以确定新发现的和已报道的SNP的发生频率。
通过DHPLC和确证性双链DNA测序的方法，他们筛查了96-144个CHF病人
的9个主要信号传导基因的56个编码外显子，并且发现了17个新的和8个报
道过的同义SNP,以及一个新的非同义SNP。由于对NCBI和Celera数据库最
初的实验中漏筛了多个SNP很感兴趣，他们又检测了10个已报道过的非同义
SNP，结果在74-91个CHF病人样品中并未发现这些SNP。他们将实验结果与
NCBI和Celera的数据进行比较，发现数据库中56%的SNP并未在他们的样品
中发现，而实验中发现的SNP中的69%并不存在于数据库中。这项研究表明绝
对性地将现有数据库作为多态标记的来源，并只使用这些标记物会导致错误的
实验结果。另外一项最新的研究[34]表明SNP数据库中关于25个G蛋白耦连受
体的数据只有32%能在样本量为60的实验中被确证。这说明利用DHPLC对现
有数据库中的SNP数据进行确证是一种在更大规模实验前对标志物进行评估的
可靠方法。
神经精神疾病
基因编码区的SNP可被用来做关联实验，以确定复杂疾病的遗传基础[35，
36]。而这种实验的成功与否极大程度上取决于疾病相关等位基因的频率以及它
们在不同种族人群中的分布[37]。如果待测序列的高危等位基因频率很低，那么
直接确定突变序列基因型的方法就不适用了。以往对基因的分析表明大多数基
因突变频率很低（<0.05），而且低于75的样本量也会限制检测稀少等位基因的
能力[38]。最近有文献[39]介绍了一项研究，利用DHPLC对神经精神疾病相关
的两个基因的编码区和剪接结合部的突变序列（频率很低）进行大样本量筛查
（n=450）。结果表明这两种基因，SLC6A4（编码5-羟色胺转运蛋白）和SLC18A2
（编码血管单胺转运蛋白），在等位基因变异的数目和频率方面存在明显的差
异。如果将这样的变异基因比较扩展到更大范围的基因中去，那么就有可能确
定特定形式的遗传变异与基因功能之间的关联。
阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)是一种渐进性神经退行性病变，它是由复杂的遗传和环
境因素共同造成的。一项成功的SNP研究确定载脂蛋白E（APOE）基因（等
位基因4）是一个易感性位点，可能增大迟发性阿尔茨海默病（LOAD）的发病
几率[40]。到目前为止，这是唯一的被证实的LOAD易感性标志。一项最近的
研究对位于12号染色体的编码氧化低密度脂蛋白（LDL）受体1（OLR1）的基
因进行分析[41]。研究者利用DHPLC对50名AD患者的全部OLR1外显子和
内含子/外显子交界部位进行了突变序列筛查。结果有三种新的遗传变异被鉴别
出来，它们全部位于非编码区域。在对超过800个LOAD病例的基因型分析表
明上述的SNP与AD之间存在明显的关联，其中最重要的是位于非APOE4区
域的3’-UTRSNP。关于遗传变异对早发性阿尔茨海默病（EOAD）和LOAD已
有大量报道（见阿尔茨海默病突变数据库
http://molgen-www.uia.ac.be/ADMutations/）。
例如编码淀粉样前体蛋白的基因（APP）和编码早老素的基因（PSEN1,PSEN2）
发生突变会通过改变γ-分泌酶活性一起少见的早发性阿尔茨海默病（EOAD）。
近来一种名为nicastrin(NCSTN)的跨膜糖蛋白被确定是γ-分泌酶复合物的一部
分，而后者可切割淀粉样前体蛋白（APP）[42]。NCSTN被定位于1q23，一个
与LOAD相关的区域。近来有一项研究利用DHPLC对两名荷兰的EOAD或
LOAD患者进行了NCSTN基因突变检测[43]。结果在NCSTN基因中发现了14
种新的SNP，其中之一可能能增大EOAD的发病几率。
心脏病
近来有大量的研究通过对突变序列的鉴别研究各种心脏疾病的相关基因。
家族性肥大性心肌病（HCM）是一种常见的常染色体遗传病，病变部位为心肌
小节。在9种编码肌小节蛋白的基因中发现的突变已经证明与HCM相关[44]。
最常见的突变基因是编码β-肌球蛋白重链的MYH7基因，而功能相关性突变发
生在编码区域的5’端部分。近来有研究利用DHPLC技术来筛查MYH7基因编
码酶解肌球蛋白轻链(LMM)的编码区3’端部分。结果研究者发现了破坏MYH7
基因功能的突变[45]，这说明只有进行全基因突变筛查才能保证正确的诊断。另
外超过1/3的HCM病例没有发现任何突变，无论是在已知的肌小节基因，还是
在与心脏能量稳态相关的其他基因中，结果都一样。利用DHPLC技术对重症
HCM家系的编码AMP依赖蛋白激酶的γ2亚基的PRKAG2基因进行的突变筛
查证明能量耗竭是心肌功能失常的主要成因[46]。近来对HCM致病基因的遗传
异质性的深入研究[44，47]表明扩大对HCM的遗传检测是非常有必要的。
近来还有许多关于其他心肌疾病的候选基因筛查研究。如对位于1q42-q43
的一些疾病相关基因进行DHPLC突变筛查[48]。结果在一个患有致心律失常性
右心室心肌病2（ARVD2）的家系中发现了一种编码心脏ryanodine受体(RYR2)
的基因突变。这些突变的识别为进行症前诊断提供了一个标志物，也为早期监
测和治疗干预提供了机会。这些发现也有可能促成更特异有效的药物干预。
自身免疫病和炎症
另一个焦点研究领域是筛查自身免疫病和炎症相关的基因突变。利用
DHPLC技术，研究者已识别出了多种致病基因突变如PAPA综合征（脓性无菌
性关节炎，坏疽性脓皮病和粉刺），和家族性复发性关节炎（FRA）（一种主要
影响皮肤和关节组织的早发性遗传病）的致病基因突变[49]。而研究者指出这
些突变影响了正常炎症反应的信号传导通路，因此这类自身免疫病有可能与普
通的炎症性疾病如风湿性关节炎，炎性肠病等有相同或相似的病因。利用
DHPLC技术，研究者也在编码胸腺特异性丝氨酸蛋白酶（PRSS16）的基因中
发现了一些SNP，这些基因变异位于HLA复合体中，后者包含有多种免疫疾病
的相关基因[50]。这些基因突变中的一部分有生物学作用，有必要深入研究它们
的疾病相关性（如与糖尿病的关联）。
蛋白水解酶和它们的抑制剂在维持免疫系统稳态过程中发挥重要的作用。
因此这些蛋白的突变形式有可能产生显著的生物学后果。利用DHPLC技术，
研究者在编码丝氨酸蛋白酶抑制物Kazal-5蛋白（LEKT1）的SPINK5基因中
发现了一组突变，而这种基因是一种常染色体隐性遗传皮肤病Netherton综合征
的缺陷基因[51]。LEKT1是第一个被发现参与免疫疾病的丝氨酸蛋白酶抑制物。
现已发现许多编码与LEKT1类似的丝氨酸蛋白酶抑制物和激活物的基因突变
与疾病相关，如Kazal-1胰蛋白酶抑制物与慢性胰腺炎（CP），以及组织蛋白酶
C与牙周疾病等。
CP是一种严重时可能危害生命的疾病。在过去的几年中，已有三种基因被
发现与CP有关，它们是CFTR,PRSS1和PST1[52]。近来有一项研究利用
DHPLC技术在39个病人中对上述三种基因的整个编码区域和剪接结合部位进
行突变状况的筛查[53]。结果表明约30%的受检者至少有一种基因发生一种突
变。但这不包括新发现的不普遍的基因突变，而这些突变中的一些还有可能具
有功能意义。只有三个病人至少有两种基因中发生了突变。这些少见的病例表
明在CP易感性位点之间存在某种关联。这项研究也提供了一次对一种常见疾病
的不同基因突变的杂合状态进行研究的独特机会。
遗传变异研究在临床治疗中的意义
药物代谢和耐药性
遗传药理学是一种研究基因在个体对药物治疗和环境因素的生物学反应中
所起作用的学科。不同个体对药物反应存在固有的差异，一些常用药物在几种
重要疾病中的作用请见表3[54]。个体对药物的反应直接受个体的基因型和生活
形式的影响。确定个体的基因突变类型无论对科学家或临床医生来说都是一项
艰巨的任务。但是这种研究却可以区别可能与不可能发生药物反应的患者，以
及识别那些可能发生严重反应的高危患者。因此无论从用药的有效性或安全性
来说，对患者进行遗传实验，以预测他对一种特殊药物的反应十分有必要。这
种研究对将带有特定遗传药理学标记的患者分组进行临床实验也有很大的帮
助。
编码细胞色素，甲基转移酶等代谢酶类的基因多态性对药物反应有显著的
影响。这些酶类参与细胞对药物的吸收，分布，降解和清除等活动。因此确定
影响药物代谢的突变等位基因可以帮助临床医生预测患者对治疗的反应。
DPYD
一项介绍DHPLC技术筛查编码二氢嘧啶脱氢酶（DPD）的基因DYPD的
报道证明了识别突变等位基因的遗传药理学价值[55]。这种酶可以催化抗癌药物
5-氟尿嘧啶(5-FU)代谢的限速步骤。DPD缺乏会导致5-FU用药后的严重毒性，
因此在使用5-FU进行化疗之前，确定癌症患者的DPD遗传状态具有重要的价
值。然而DYPD基因的复杂性和大小（23个外显子，150-950kbp）使许多研究
者对研究DPD缺乏的遗传基础望而却步。一项利用DHPLC技术对上述基因的
筛查研究检测到全部21个以前有报道的基因突变，并且鉴别出了纯合与杂合基
因型，证明DHPLC是一种能够准确，敏感，低消耗地检测具有重要临床意义
的基因突变的方法。DHPLC的所有这些特点对于以复杂基因（如DYPD）突变
筛查为目的的病人或自然人群研究是非常合适的
编码TPMT的基因
巯基嘌呤S-甲基转移酶（TPMT）是一种位于细胞质，催化巯基嘌呤S-甲
基化的酶类。巯基嘌呤是一种免疫抑制剂，可被用来治疗急性淋巴细胞白血病
以及风湿性关节炎[56]。编码TPMT的基因多态性对巯基嘌呤的代谢有严重的
影响，目前已有10种影响表型的突变等位基因被识别出来[57]。一种利用
DHPLC快速筛查TPMT相关突变的临床检测方法已经形成[58]。在一项相关研
究中，有98份来自于正在接受或接受过巯基嘌呤治疗的人群的DNA样品被用
来筛查TPMT突变。通过直接测序证实，DHPLC可以鉴别出样品中全部（100%）
突变等位基因。DHPLC对TPMT相关突变的评估是建立在清晰的洗脱结果基
础上的。如果拥有一套参照数据，DHPLC的洗脱结果可被用来预测序列突变的
类型[59]。可见DHPLC这种自动技术可被临床实验室用来确定TPMT等基因
突变的基因型，以及筛查新的突变。
Imatinib
对从事药物研发基础研究的工作者来说，DHPLC是一种有价值的辅助工具。
例如近来有研究表明在对白血病患者的治疗过程中，BCR-ABL激酶激活位点的
基因区域的多种突变对酪氨酸激酶抑制剂Imatinib的耐药性有影响[60]。这项重
要的发现对于确定需要改变治疗策略的耐药性水平有重大意义。Imatinib的其它
目标以及酪氨酸激酶抑制剂的其它作用对象的耐药性机制可能与上述研究结果
相似。最近有一项研究利用DHPLC技术对Imatinib的一个作用对象c-kit进行
了突变筛查[61]。研究结果显示不同时期的胃肠道基质瘤（GIST）都有c-kit基
因突变。这些突变在早期良性的胃肠道基质瘤中存在率较高，这说明c-kit在早
期GIST发展中起作用。重要的是，这些带有突变的GIST类型已被加入了
Imatinib的适用范围中。虽然c-kit并不是GIST由良性转向恶性的标志，但它
却是有用的耐药性指标。可见准确而敏感的对酪氨酸激酶基因靶点的突变研究
能够在不存在类似耐药性的新型抗癌药物研发过程中起到辅助的作用。
VEGF
参与血管生成的基因也是目前深入研究的重要药物靶点。人类血管内皮生
长因子（VEGF）由肿瘤细胞分泌，以自分泌的形式作用于内皮细胞。最近有人
对人类结肠直肠癌中VEGF的基因突变情况进行了研究[62]。结果发现了4个剪
接结合部变异位点和6个新的基因突变。这些突变可能在肿瘤-宿主反应的生物
多样性方面具有重要影响，也可能对药物靶点研究很有价值。
上面这些文献报道为识别和确定与发病危险性，药物反应和耐药性相关的
基因变异提供了理论和应用的介绍。而分析标志等位基因（基因型）和临床特
征（表现型）之间的关系对治疗策略的制定有重要的意义。相信在不久的将来，
对临床相关基因突变的准确识别能帮助医务工作者制定针对每个病人的独特治
疗方案，从而提高对疾病的治疗和控制水平。
总之，近几年来，DHPLC技术飞速发展，利用DHPLC对大量的疾病相关
基因突变进行筛查，如下表：
Table1.Recentgenesassociatedwithinheriteddisordersscannedformutationsby
DHPLC.Transgenomic
GeneMIM
number1
ExonsDiseaseReference
ABCA4(ABCR)60169150Maculardegeneration〔71〕
ADRB2109690Intron-lessAsthma;chronicobstructivepulmonarydisease;
CHF
〔33··,72〕
ALAP145500-Essentialhypertension〔73〕
ALG3601110-Congenitaldisorderofglycosylation〔74〕
ALG6604566-Congenitaldisorderofglycosylation〔74〕
APM16054413TypeIIdiabetes〔75〕
APOD1077405Cardiovascular;lipidmetabolism〔76〕
ATPB760688221Wilson’sdisease〔77〕
CFTR(ABCC7)60242127CF;idiopathicCP〔8·,53,78,79〕
CHAC20015073Chorea-acanthocytosis〔80〕
CHX101429935Microphthalmia;anophthalmia〔81〕
CLCN111842523Myotonia〔82〕
CRB160421011Lebercongenitalamaurosis〔83〕
CRX6022253Lebercongenitalamaurosis〔83〕
CPM16035039Congenitaldisorderofglycosylation〔74〕
DPYD274270235-FUtoxicity〔55··〕
DRD21264507CMTdisease〔84〕
DRD31264518Schizophrenia〔85〕
EGR21290102CMTdisease〔9··〕
F8C(FactorVIII)30670024HemophiliaA〔86,87〕
FBN113479765Marfansyndromeandrelatedconnectivetissue
disorders
〔88,89〕
GAD213827517TypeIdiabetes〔90〕
GJB13040402CMTdisease〔9··〕
GJB21210112Hereditaryhearingloss〔91,92〕
GNA111393133CHF〔33··〕
GNAQ600998Intron-lessCHF〔33··〕
GNAS13932013CHF〔33··〕
GeneMIM
number1
ExonsDiseaseReference
GRIN113824921Schizophrenia〔93〕
GRIN2A13825314Schizophrenia〔93〕
GRIN2B13825213Schizophrenia〔93〕
GRIN2C13825413Schizophrenia〔93〕
GRIN2D60271713Schizophrenia〔93〕
HBB1419003?-Thalassemia〔94,95〕
HFE2352007Hereditaryhemochromatosis〔96〕
HPRP3601850-Autosomaldominantretinitispigmentosa〔97〕
K91442006Epidermolyticpalmoplantarkeratoderma〔98〕
KCNE11762613CongenitallongQTsyndrome(LQTS)〔99〕
KCNE26037961CongenitalLQTS〔99〕
KCNH215242715CongenitalLQTS〔99〕
KCNJ106022082TypeIIdiabetes〔100〕
KCNQ119250016CongenitalLQTS〔99〕
KvLQT1220400-JervellandLange-Nielsensyndrome(JLSN1)〔101〕
LDLR14389018Familialhypercholesterolemia〔102,103〕
LHCGR15279011Leydigcellhypoplasia〔104〕
LIPC1516709Coronaryarterydisease〔105〕
LPL23860010Coronaryatheroscleroticheartdisease〔105〕
MAG15946012Multiplesclerosis〔106〕
MAPK11769488CHF〔33··〕
MC4R155541Intron-lessEarly-onsetobesity〔107〕
MIF1536203Systemic-onsetjuvenileidiopathicarthritis〔108〕
MLC160590812Schizophrenia〔109〕
MPI154550-Congenitaldisorderofglycosylation〔74〕
MPDU16040417Congenitaldisorderofglycosylation〔74〕
MTM131040015X-Linkedmyotubularmyopathy〔110〕
MYH716076039FamilialHCM〔44,45〕
MYOC6016523Openangleglaucoma;ocularhypertension〔111〕
NAB16008007Peripheralneuropathy〔112〕
NAB26023817Peripheralneuropathy〔112〕
NCSTN60525417AD〔43〕
NTF3162660-Schizophrenia〔113〕
OA13005009X-Linkedocularalbinism〔114〕
OPRM16000183Heroinaddiction;idiopathicgeneralizedepilepsy〔115,116〕
PAX610621014Microphthalmia;anophthalmia;coloboma〔81〕
PCDH86035803Schizophrenia〔117〕
PKD16013134Autosomaldominantpolycystickidneydisease
(PKD)
〔118〕
PKD217391015AutosomaldominantPKD〔118〕
PKHD160670267AutosomaldominantPKD〔119,120〕
PMM26010978Carbohydrate-deficientglycoproteinsyndrometype
1A
〔74〕
PMP226010973CMTdisease〔9··〕
PRSS12760005Hereditarypancreatitis;idiopathicCP〔53〕
PRSS1660716912Autoimmunity〔50〕
PTPN1117687614Noonansyndrome;:ROPARDsyndrome;
Cardiofaciocutaneoussyndrome
〔121,122〕
RAB3A1794905CHF〔33··〕
RAB41795118CHF〔33··〕
RAB5C6040375CHF〔33··〕
RAD1795038CHF〔33··〕
RPE6518006914Lebercongenitalamaurosis〔83〕
RPGRIP160544615Lebercongenitalamaurosis〔83〕
SIX36037142Microphthalmia;anophthalmia;coloboma〔81〕
SLC6A418213813Anxietydisorders〔39··〕
SMN16003548Spinalmuscularatrophy〔123〕
SPINK11677904IdiopathicCP〔53〕
SPINK560501028Nethertonsyndrome〔51〕
SUOX2723003Sulfocysteinuria〔124〕
TGM219019613Maturith-onsetdiabetes(MODY)〔125〕
TNFRSF1A19119010Tumornecrosisfactorreceptor-associatedperiodic
syndrome
〔126〕
TSC160528421Tuberoussclerosis〔11·,127〕
TSC219109241Tuberoussclerosis〔11·,12·,127〕
VHL1933003Hippel-Lindaudisease〔128〕
WFS16062018Wolframsyndrome〔129〕
Table2.CancergenesrecentlyscannedformutationsbyDHPLC.Transgenomic
GeneMIM
number1
ExonsDiseaseReference
APC17510015Colorectalcancer〔17··,130-133〕
ATM20890062Hereditary,sporADIcbreastandovariancancer〔134〕
AXIN160381610Hepatocellularcarcinoma〔135〕
AXIN26040252Hepatocellularcarcinoma〔135〕
BRCA111370523Hereditarybreastandovariancancer〔7·,136,137〕
BRCA260018528Hereditarybreastandovariancancer;sporadic
exocrinepancreaticcancer
〔136-138〕
CDH119209016Hereditaryprostatecancer;sporadicductaland
lobularbreastcancer
〔139,140〕
CTNNB111680616Uvealmelanoma;hepatocellularcarcinoma〔135,141〕
DBC2--Breastcancer〔142〕
ELA2(NE)1301305Lungcancer〔143〕
FAM10A4606796-B-cellchroniclymphocytesleukemia〔144〕
?-GCS--Lungcancer〔145〕
GSTP11346607Lungcancer〔145〕
GSTM11383508Lungcancer〔145〕
GSTT16004365Lungcancer〔145〕
INK4A6001603Melanoma〔146〕
KIT60676421GISTs〔61··〕
K-ras6015996Colorectalcancer〔17··〕
MET16486021Papillaryrenalcarcinomas〔147〕
MLH112043619Hereditarynonpolyposiscolorectalcancer;
endometrialcaricinoma
〔148,149〕
MLH360439513Colorectalcancer〔16·〕
MSH212043516Hereditarynonpolyposiscolorectalcancer;
endometrialcaricinoma
〔148,149〕
MUTYH60493316Hereditarynonpolyposiscolorectalcancer〔132,133〕
MYO18BLungcancer〔150〕
NBS160266716Acutelymphoblasticleukemia;colorectal
carcinoma
〔151〕
P14(ARF)6001603Uvealmelanoma〔141〕
P15(INK4B)6001603Uvealmelanoma〔141〕
P16(INK4A)6001603Uvealmelanoma〔141〕
PTEN/MMAC16017289Endometrialcarcinoma;neuroblastoma〔148〕
RNASEL1804356Prostatecancer〔152〕
SMAD460701013Uvealmelanoma;pancreaticcancer〔141〕
TGFBR21901827Uvealmelanoma〔141〕
TP53(p53)19117011Variouscancers〔13,17··,141〕
耐药性相关基因突变的微生物学识别和检测
随着耐药性微生物的大量出现，针对传染性病原体的治疗策略制定和药物
研发变得越来越难。抗微生物治疗面临挑战的一个重要原因就是缺乏能够准确
识别致病微生物和耐药基因的有效临床手段。然而近来发展起来的能识别病原
体和研究微生物抗药性的分子生物学方法又为抗微生物治疗和药物研发建立了
希望。下面将对利用DHPLC技术，成功识别致病细菌以及细菌耐药性基因突
变的研究进行简要的总结。
从临床治疗的角度来看，准确确定致病微生物的种类具有重要的价值，它
可以保证用药的有效性。Hurtle在他的文章[63]中指出DHPLC技术能有效的识
别病原微生物。作者利用万能PCR引物从多种细菌的转录16S核糖体RNA的
基因中产生出一条320-bp的扩增片段。将这些来自不同种类细菌的扩增产物与
参照物混和后进行DHPLC检测，会产生一个独特的色谱结果。而该结果可以
作为鉴定细菌种类的分子指纹。
在一场大范围疫情爆发中，从菌株水平确定病原菌是至关重要的。只有了
解了致病菌株才能正确选择抗菌药物。Shlush等指出将PCR,DHPLC和多位点
序列分型（MLST）技术相结合可以从菌株水平识别病原菌[64]。MLST技术利
用位于非连锁位点的管家基因来进行微生物分型[65]。研究人员PCR扩增管家
基因区域，并将扩增产物与对照物混和。通过DHPLC检测，产生每个管家基
因的特定的色谱结果[64]。实际上DHPLC的分析能力在没有测序的情况下远远
超过MLST。
对已知和未知的耐药性基因突变的检测对于评估现有和新开发的抗生药物
至关重要。而DHPLC可以准确地检测耐药性相关基因突变。一项筛查肠炎沙
门菌抗quinolonegyrA基因突变的研究[66]表明，在准确性方面，DHPLC远远
超过了其它检测单碱基突变的分子生物学方法，如单链构象多态性，和轻环
PCR-gyrA杂交突变检测技术(GAMA)等。Hannachi-M’Zali也在文章中[67]指
出DHPLC是检测甲氧西林耐受的金黄色葡萄球菌的抗quinolonegyrA，gyrB,
grlA和grlB基因突变的有效方法。而Cooksey则利用DHPLC技术建立了抗结
核药耐受性相关基因突变筛查的常规方法[68]。上面的研究表明将DHPLC与其
它分子生物学方法结合使用，可以了解引起耐药性的基因突变，从而促进特异
性药物的研发。
DHPLC技术在微生物学研究中的应用并不仅限于细菌相关的工作。它也可
被用在真菌，病毒和寄生虫等研究领域，以识别微生物和检测抗药基因突变。
使用DHPLC技术对抗生药物的研发由三点益处。第一，DHPLC技术可以可靠
地从种属和菌株水平识别微生物，弥补传统的表型识别方法的缺陷。第二，
DHPLC技术可以高度准确地检测耐药基因突变。第三，DHPLC技术具有从混
合微生物群落中识别突变种类的能力。从异源混合物中检测遗传突变基因对于
监测感染过程中病原微生物耐药性的变化至关重要。上述观点的一个重要例证
是人免疫缺陷病毒1（HIV-1）的进化过程[69]。在活体标本中发现了由主要HIV-1
蛋白酶基因和少数突变基因组成的复杂的病毒准种。在没有选择压力的情况下，
耐药突变基因的出现频率低于野生型基因。而抗药选择可以使这种突变基因成
为主要基因型。这种关于HIV-1病毒准种的分析可使研究者深入了解病毒进化
过程中病毒群落的复杂变化。但是这种病毒群落的分析是一项艰巨的任务，因
为低频率的突变很难通过测序检测到，亚克隆病毒PCR产物的测序结果会偏向
频率高的突变类型[70]。DHPLC等技术能提高检测少数耐药突变的能力，进而
促进HIV-1等传染病的治疗。
结论
由于准确，敏感的DHPLC突变检测技术的发展，新发现的基因突变数目
正在快速增长。DHPLC突变检测技术对人类疾病发生，易感性和治疗相关基因
突变以及连锁标志物的识别做出了重要的贡献。由于环境，生物学和进化因素
等不同选择机制的使用，新发现的遗传等位基因将越来越多。而发现与肿瘤基
因，病原微生物的病毒因素，以及特定药物靶点相关的新的低水平的基因突变
将是一项持久性的任务。采用DHPLC技术筛查基因突变，将会使这项任务更
好地进行，并促进高效的药物研究和开发。
致谢
在此我想感谢DrsJosephBreen,GeorgeHong,PhillipEastlake,Felix
Frueh和MarioNoyer-Weiner等对这篇文章的创作所付出的饱含思想性的努
力。我也想感谢AmandaMiller-Lindholm和CarlaShaw-Bruha对表1，2的制
作所给予的帮助。
参考文献

属于的，基因测序属于体外诊断，一般的样本可检测唾液，血液，组织细胞，口腔上皮细胞等等，都是在体外进行PCR检测的，所以做基因检测所需要的试剂 和试剂盒都是体外诊断试剂

Illuminamiseq测序是不是只测DNA的5到3方向的单链，而3到5在簇单链生成的时候被去掉了？是在rd1和index测序之前只有3到5单链共价结合在flowcell上？

麻烦问一下，RNA测序的原理和方法是什么？为什么不能直接测序，而要转成CDNA在测序呢?谢谢了~~

很不错的，佳学基因利用基因检测技术和基因解码技术，可以进行天赋潜能发现和评估。利用肿瘤基因检测进行肿瘤风险评估。这个根医院的体检不一样。佳学基因肿瘤风险基因检测可以在没有发病的时候，发现疾病风险，通过积极预防，将肿瘤发病风险消除在萌芽之中。通过佳学基因检测，还可以发现肿瘤的致病机理，采用不同于化疗、放射性治疗不一样的治疗方法。因此，佳学基因基因检测，代表的是一种更先进的健康管理技术。这种技术经过佳学基因进一步发展，用在了肿瘤分子分型基因检测，常见疾病风险评估、分子病理分型、药物的选择和剂量优化中，从不同层面提高我们的生活品质。由于基因检测的预见性，它可以知道在两个人婚后，所生的孩子的天赋潜能、性格特征等。一句话，基因检测、基因解码技术是人体生命活动信息利用技术，它不同于医院体检。您选用正确的基因检测技术，就表明您在生活能力、健康管理、家庭幸福方面已经比别人先行一步了。

摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。

图1：测序技术的发展历程

　　生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。

第一代测序技术

　　第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）.并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。

　　值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

图2：Sanger法测序原理

第二代测序技术

　　总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。表1和图3对第一代和第二代测序技术各自的特点以及测序成本作了一个简单的比较5，以下我将对这三种主要的第二代测序技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。

图3.测序成本的变化

Illumine

　　Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的2,4。这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法，它的测序过程主要分为以下4步，如图4.

（1）DNA待测文库构建

　　利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。

（2）Flowcell

　　Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。

（3）桥式PCR扩增与变性

　　桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增，如图4.a所示。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。

（4）测序

　　测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间，测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约为1周。

图4.Illumina测序流程

Roche454

Roche454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理是（图5abc）2：

（1）DNA文库制备

　　454测序系统的文件构建方式和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库（图5a）。

（2）EmulsionPCR（乳液PCR，其实是一个注水到油的独特过程）

454当然DNA扩增过程也和illumina的截然不同，它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。

　　乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”（水包油），基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。

　　这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增，并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后，可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。

（3）焦磷酸测序

　　测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上。这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。　　

　　测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，从而导致荧光淬灭，以便使测序反应进入下一个循环。由于454测序技术中，每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，当前454技术的平均读长可达400bp，并且454技术和illumina的Solexa和Hiseq技术不同，它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，这就有可能导致结果不准确。也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。

图5.Roche454测序流程

Solid技术

Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。它基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序（图6）2,4。它的原理是：

图6-a.Solid测序技术

（1）DNA文库构建

片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。

（2）EmulsionPCR

Solid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsionPCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域（图6-a）。Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。

（3）连接酶测序

这一步是Solid测序的独特之处。它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3’-XXnnnzzz-5’。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图6-a）。这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。这种测序方法也称之为两碱基测序法。当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号，图6-a和图6-b中的比色版所表示的是第1，2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。在记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序。不过值得注意的是，通过这种测序方法，每次测序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在测到末尾后，要将新合成的链变性，洗脱。接着用引物n-1进行第二轮测序。引物n-1与引物n的区别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基（图6-a.8）。也即是，通过引物n-1在引物n的基础上将测序位置往3’端移动一个碱基位置，因而就能测定第0、1位和第5、6位……第二轮测序完成，依此类推，直至第五轮测序，最终可以完成所有位置的碱基测序，并且每个位置的碱基均被检测了两次。该技术的读长在2×50bp，后续序列拼接同样比较复杂。由于双次检测，这一技术的原始测序准确性高达99.94%，而15x覆盖率时的准确性更是达到了99.999%，应该说是目前第二代测序技术中准确性最高的了。但在荧光解码阶段，鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发生错误就容易产生连锁的解码错误。

图6-b.Solid测序技术

第三代测序技术

　　测序技术在近两三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。

　　其中PacBioSMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想5，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是：DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记4种碱基（即是dNTP）,在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。PacBioSMRT技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW（零模波导孔）原理：如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。小孔直径有考究,如果直径大于微波波长,能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来，从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长,能量不会辐射到周围，而是保持直线状态（光衍射的原理）,从而可起保护作用。同理,在一个反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔,即ZMW(零模波导孔),外径100多纳米,比检测激光波长小(数百纳米),激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限制在一个小范围(体积20X10-21L)里,正好足够覆盖需要检测的部分,使得信号仅来自这个小反应区域,孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中,从而实现将背景降到最低。另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息（图7）。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%,但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。

图7.PacBioSMRT测序原理

　　OxfordNanoporeTechnologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术5。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基（图8）。

　　该公司在去年基因组生物学技术进展年会(AGBT)上推出第一款商业化的纳米孔测序仪，引起了科学界的极大关注。纳米孔测序（和其他第三代测序技术）有望解决目前测序平台的不足，纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100kb;错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端;数据可实时读取;通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成);起始DNA在测序过程中不被破坏;以及样品制备简单又便宜。理论上，它也能直接测序RNA。

　　纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。并且改方法的测序准确性可达99.8%，而且一旦发现测序错误也能较容易地进行纠正。但目前似乎还没有应用该技术的相关报道。

图8.纳米孔测序

其他测序技术

　　目前还有一种基于半导体芯片的新一代**性测序技术——IonTorrent6。该技术使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应池中的PH发生改变，位于池下的离子感受器感受到H+离子信号，H+离子信号再直接转化为数字信号，从而读出DNA序列（图9）。这一技术的发明人同时也是454测序技术的发明人之一——JonathanRothberg，它的文库和样本制备跟454技术很像，甚至可以说就是454的翻版，只是测序过程中不是通过检测焦磷酸荧光显色，而是通过检测H+信号的变化来获得序列碱基信息。IonTorrent相比于其他测序技术来说，不需要昂贵的物理成像等设备，因此，成本相对来说会低，体积也会比较小，同时操作也要更为简单，速度也相当快速，除了2天文库制作时间，整个上机测序可在2-3.5小时内完成，不过整个芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常适合小基因组和外显子验证的测序。

图9.IonTorrent

小结

　　以上，对各代测序技术的原理做了简要的阐述，这三代测序技术的特点比较汇总在以下表1和表2中。其中测序成本，读长和通量是评估该测序技术先进与否的三个重要指标。第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外，其测序核心原理（除Solid是边连接边测序之外）都是基于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，并要保持二代技术的高通量，低成本的优点。

表1：测序技术的比较

表2：主流测序机器的成本测序比较

以下图10展示了当前全球测序仪的分布情况。图中的几个热点区主要分布在中国的深圳（主要是华大），南欧，西欧和美国。

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