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YeastRNAMiniprep
- growcellstomid-logphase(10-20ml)(ortakesamplesfromtimecourses,5-25ml)
- spincells,discardsupernatant
- washcellsoncewith1mlcoldRNAbuffer
- freezepelletindryice(andthan@-80°C)
- thawcellsonice
- add100-120µlicecoldRNA-buffer,resUSPendbyvortexing
- add1/2vol.acidwashedglassbeads
- vortexathighestlevel3minincoldroomoruseFastPrepmachine(20sec.,level4.5)
- add450µlRNA-buffer-SDS(RT),vortexbriefly
- add450µlequilibratedPhenol
- vortexathighestlevel3minincoldroom
- spinfullspeed10minincoldroom
- transferupperphasetofreshtube(donottakeanyoftheinterface!)
- add300µlequilibratedPhenol,vortex
- add300µlChloroform,vortex
- spin2min,extractupperphaseonceagainwithChloroform
- add20µl4MNaCl,1mlEthanol
- precipitate30minat-20to-80°C
- spinfullspeed10min
- washpelletwith150µl70%Ethanol
- airdrypellet
- resuspendin30-50µlH2O,storeat-20to-80°C
Buffers:(Allbuffercomponentsandstock-solutions,excepttheTris-stock-solution,areDEPCtreatedandautoclaved)RNA-buffer:50mMTris(HCl)pH7.4;100mMNaCl;10mMEDTA[for100ml:5ml1MTrispH7.4;2.5ml4MNaCl;2ml0.5MEDTA]RNA-buffer-SDS:RNA-buffer+1.3%SDS
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