一、材料

1.缓冲液和溶液

ATP(10mmol/L)

氯仿

EDTA(0.5mol/L，pH8.0)

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

乙酸钠（3mol/L，pH7.0）（使用pH7.0而不是常用的pH5.2的乙酸钠非常重要。因为对在消化后用来除去缓冲液中二价阳离子的EDTA来说，在pH5.2且浓度超过5~10mmol/L时，将从溶液中沉淀出来。）

焦糖凝胶上样缓冲液（sucrosegel-loADIngbuffer)

TE(pH7.6和pH8.0)

2.酶和缓冲液

噬菌体T4DNA连接酶

带有合适缓冲液的限制性内切核酸酶

3.凝胶

琼脂糖凝胶（0.7%)，用0.5XTBE，含0.5μg/ml溴化乙锭

4.核酸和寡核苷酸

λ噬菌体DNA

5.专用设备

预置于68℃的水浴

6.载体和菌株

λ噬菌体包装混合物

二、方法

1.将25~50μgλ噬菌体DNA与TE（pH8.0）混合至终体积为170μl。

2.加入20μl10X限制酶缓冲液。取两份未消化的噬菌体DNA，每份含0.2μg，置于冰浴保存。

3.加入3倍过量（75~150单位）的适宜限制酶，按厂家推荐的温度消化1h。

4.将反应于冰浴冷却至0℃。再取出一0.2μg的组分，将其与另一份未经消化的DNA(步骤2)于68℃温育10min，以打断噬菌体DNA黏性末端。加小量（10μl)蔗糖凝胶上样缓冲液，立刻将样品加入至0.7%的琼脂糖凝胶中。

如果限制酶消化完全，则没有DNA迁移至未消化的对照电泳带处。相反，将会看到两条或更多条（依赖于载体中切割位点的数目）较小DNA片段。仔细査看这些小片段的数量确证不存在部分酶切产物。

这一步并不像听起来那么简单。λ噬菌体DNA的左、右臂带有可互补的长为12碱基的末端，它们相互间可发生复性形成氢键，得到的DNA很容易与未切断的噬菌体DNA相混肴。由于这个原因，当DNA样品从68℃水浴取出后应立即上样和进行琼脂糖电泳。

如果消化不完全，将反应加热至适宜温度，再加入限制酶（50~100单位)，在厂家推荐的最佳温度下继续温育。

5.当消化完全后，加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)至终浓度为5mmol/L，用酚：氯仿和氯仿各抽提消化混合物一次。

6.在0.3mol/L乙酸钠（pH7.0)存在下，用乙醇沉淀将DNA从亲水相中回收回来。于4℃在微量离心机中以最大转速离心2min收集沉淀，用70%乙醇洗涤后，将DNA重溶于100μlTE(pH7.6)中，通过测定260nm的吸光率确定其浓度。

7.取一份0.5μgDNA，如下所述测试其连接能力：

(1)用水将DNA溶液的体积调整至17μl。

(2)加入2μl10X连接缓冲液，如果必要，再加入1μl10mmol/LATP。

有些商品化连接缓冲液中含有ATP。如果用这样的缓冲液，就不再需要另加ATP。

(3)取5μl步骤(2)中制成的混合物，冰浴保存。

(4)在剩余的混合物（步骤(2))中，加入0.2~0.5weiss单位的T4DNA连接酶，16℃温育2h。

(5)用一商品化的λ噬菌体包装反应将0.1μg的连接和未连接样品以及0.1μg的未消化载体DNA进行包装。