酵母双杂交可用于报道基因的种类有哪些？产物有哪些

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2017-10-01

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酵母双杂交系统由 FieldsSong等首先研究真核基转录调控建立 i .典型真核转录, GAL4、GCN4、等都含二同结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)转录激结构域(transcription-activating domain).前者识别DNA特异序列, 并使转录激结构域定位于所调节基游, 转录激结构域同转录复合体其作用, 启所调节基转录. 二结构域其连接区适部位打, 仍具各自功能.且同两结构域重建发挥转录激作用.酵母双杂交系统利用杂交基通激报道基表达探测蛋白－蛋白相互作用.主要二类载体: a 含DNA -binding domain载体; b 含DNA-activating domain载体.述二类载体构建融合基, 测试蛋白基与结构域基必须阅读框内融合.融合基报告株表达, 其表达产物定位于核内才能驱报告基转录.例GAL4-bd具核定位序列(nuclear-localization sequenc [利用酵母双杂交筛选基] 利用酵母双杂交筛选基 e), GAL4-ad没., GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆自SV40T-抗原段序列作核定位序列.目前研究用binding-domain基： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制)DNA-bd编码序列.用activating-domain基： GAL4(768-881)疱疹病毒VP16编码序列等. 双杂交系统另重要元件报道株.报道株指经改造、含报道基(reporter gene)重组质粒宿主细胞.用酵母细胞, 酵母细胞作报道株酵母双杂交系统具许优点: 〈1〉易于转化、便于收扩增质粒.〈2〉具直接进行选择标记基特征性报道基.〈3〉酵母内源性蛋白易同源于哺乳物蛋白结合.般编码蛋白基融合明确转录调控DNA－结合结构域(GAL4-bd, LexA-bd)；另基融合转录激结构域(GAL4-ad, VP16).激结构域融合基转入表达结合结构域融合基酵母细胞系, 蛋白间作用使转录重建导致相邻报道基表达(lacZ), 析蛋白间结合作用. 酵母双杂交系统能体内测定蛋白质结合作用, 具高度敏性.主要由于：①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达.②信号测定自平衡浓度条件进行, 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤,降低信号强度.③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强, 者与启DNA结合, 三元复合体使其各组结合趋于稳定.④通mRNA产种稳定酶使信号放. 同, 酵母表型, X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏.

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