Product Specifications:
Item# 1033: Recombinant HIV-1 clade E (Thai) gag p24
Concentration: See vial
Mass/vial: 100ug
Volume/vial: 100ul
Diluent: Na-Ac, 20mM,0.15M NaCl, pH.6.5
Purity: >95%
Stabilizer: None
Preservative: None
Storage: -75°C
Physical State: Frozen Liquid
Stability: At least 36 months at -75°C.
Applications: Elisa, Western Elisa, In-vitro HIV-1 Diagnostics
Description: Recombinant HIV-1clade E (Thai) gag p24 is a cytosolic protein produced in the Baculovirus Expression System.
Purification: This protein was purified by cation/anion affinity and gel exclusion chromatography to >95% purity as determined by SDS-PAGE, reduced (apparent molecular weight: 24kD). Quantitative determination of the protein was based on a sandwich capture ELISA using a qualified p24 preparation as a reference. The capture ELISA is sensitive to 1pg of p24; 1ng/ml of p24 shows an O.D. of 1.0 at 450nm under standard ELISA conditions.
Specificity: This protein binds to murine monoclonal antibodies of defined epitope specificity and to rabbit and human serum polyclonal antibodies in ELISA and Western ELISA.
Biological Activity: Not Determined
Application and Instructions for use
Recommended concentrations for use are approximate values. A dose dependent response assay should be performed to determine the optimal concentration for use in specific applications. ELISA and Western ELISA may be performed at 10-100ng protein depending on the nature and affinity of the detection reagent. HIV –1 converted uman serum polyclonal antibodies yield titers of up to 1:100,000 at 10 -100ng of immobilized protein under standard ELISA conditions.
Glossary
Gene and Gene Products
Structural Proteins: Structural proteins – the products of gag, pol and env genes, which are essential components of the retroviral particle.
Regulatory Proteins: Regulatory proteins – tat and rev proteins of HIV/SIV and tax and rex proteins of HTLVs; essential for viral expression in infected cells.
Accessory Proteins: Accessory proteins – additional (non-regulatory) virion – and non virion-associated proteins produced by HIV/SIV retroviruses: vif, vpr, vpu, vpx, and nef. Although, the accessory proteins are not necessary for viral propagation in tissue culture, they have been conserved in the different isolates; this conservation and experimental observations suggest that their role in vivo is very important.
gag
gag – group-sepecifc antigens or capsid proteins; the precursor is the p55 myristoylated protein, which is processed to p17 (Matrix) p24 (Capsid) and p7 (NucleoCapsid) proteins by the viral protease. Other small proteins are generated from the gag polyprotein.
pol
pol – (p66) generates the viral enzymes protease (p11), reverse transcriptase (p51), endonuclease and integrase (p32) after the processing of a gag-pol precursor polyprotein by the viral protease; gag-pol precursor is produced by ribosome frameshifting.
env
env – viral glycoproteins produced as a precursor (gp160) and processed to the external glycoprotein (gp120) and the transmembrane glycoprotein (gp41). The mature proteins are held together by noncovalent interactions; as a result substantial amount of gp120 is released extracellularly. The external glycoprotein (gp120) contains the binding site for the CD4 receptor.
tat
tat – transactivator of HIV gene expression; one of the two necessary viral regulatory factors (tat and rev) for HIV gene expression. Two forms are known, tat-1 exon (minor form) of 72 amino acids, and tat-2 exon (major form) of 86 amino acids. The electrophoretic mobility of these two forms in SDS gels is anomalous; they are approximately 16 kD and 14 kD in weight. Low levels of both proteins are found in persistently infected cells. tat is localized primarily in the nucleolus/nucleus; it acts by binding to the TAR RNA element and activating transcription from the LTR promoter. Post-transcriptional effects of tat have been postulated.
rev
rev – the second necessary regulatory factor for HIV expression. A 19 kD phosphoprotein localized primarily in the nucleolus/nucleus, rev acts by binding to RRE and promoting the nuclear export, stabilization and utilization of the viral mRNAs containing RRE.
vif
vif – viral infectivity factor, typically 23 kD; required for the efficient transmission of cell-free virus in tissue culture. In the absence of vif, the produced viral particles are defective, while the cell-to-cell transmission of virus is not affected significantly. It has been reported that the cellular localization is in the Golgi (vif is not found in the virion).
nef
nef – approximately 27 kD non-virion protein found in the cytoplasm of infected cells. Potentially myristoylated and associated with the inner plasma membrane. One of the first HIV proteins to be produced in the infected cells, it is the most immunogenic of the accessory proteins and may be used in the future for diagnosis and staging of the disease. NEF is dispensable and probably suffers counter-selection during ex vivo viral propagation in vivo. Recent evidence suggests that SIV nef is required for viral propagation in vivo.
vpr
vpr – virion-associated protein of unknown function found in HIV-1, HIV-2, SIVmac, and SIVmnd; typically 15 kD. May be homologous to vpx. Also called “rap” for rapid.
vpu
vpu – protein that promotes extracellular release of viral particles. Found only in HIV-1. Integral membrane phosphoprotein of 16kd; similar to M2 protein of influenza virus. It may be involved in env maturation. It is not found in the virion.
vpx
vpx – virion protein of 12 kD found only in HIV-2 infection. (vpx may have some homology with vpr).
Related research paper:
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发展起各种双杂交系统Fields等建立系统基础些新系统主要报道基、诱饵表达载体及猎物表达载体等做些改进其重要改进引入额外报道基广泛采用HIS3基经改造带HIS3报道基酵母细胞HIS3启表达才能缺乏组氨酸选择性培养基HIS3报道基转录表达由诱饵猎物相互作用所启数双杂交系统往往同使用两甚至三报道基其 LacZ些改造基启区相同转录激结合位点相同转录激（述Gal4蛋白）激通种双重或重选择既提高检测灵敏度减少假阳性现象其针诱饵或猎物表达载体等所作改进详述
双杂交鉴定程要经两转化工作量相特别寻找新作用蛋白质候尤其且酵母细胞转化效率比细菌要低约4数量级转化步骤双杂交技术瓶颈Bendixen等通酵母接合型引用避免两转化操作同提高双杂交效率酵母性殖程涉及两种配合类型：a接合型α接合型两种单倍体间接合（mating）能形二倍体a接合型细胞间或α接合型细胞间能接合形二倍体根据酵母性殖特点文库质粒转化α接合型酵母细胞诱饵表达载体转化a接合型细胞别铺筛选平板使细胞菌苔（lawn）再两种菌苔复印同三重筛选平板原则诱饵靶蛋白发相互作用二倍体细胞才能平板单倍体细胞或虽二倍体细胞BD融合蛋白AD融合蛋白相互作用都淘汰克隆进步通β-半乳糖苷酶力进行鉴定项改进仅简化实验操作且提高双杂交筛选效率
发展起各种双杂交系统Fields等建立系统基础些新系统主要报道基、诱饵表达载体及猎物表达载体等做些改进其重要改进引入额外报道基广泛采用HIS3基经改造带HIS3报道基酵母细胞HIS3启表达才能缺乏组氨酸选择性培养基HIS3报道基转录表达由诱饵猎物相互作用所启数双杂交系统往往同使用两甚至三报道基其 LacZ些改造基启区相同转录激结合位点相同转录激（述Gal4蛋白）激通种双重或重选择既提高检测灵敏度减少假阳性现象其针诱饵或猎物表达载体等所作改进详述
双杂交鉴定程要经两转化工作量相特别寻找新作用蛋白质候尤其且酵母细胞转化效率比细菌要低约4数量级转化步骤双杂交技术瓶颈Bendixen等通酵母接合型引用避免两转化操作同提高双杂交效率酵母性殖程涉及两种配合类型：a接合型α接合型两种单倍体间接合（mating）能形二倍体a接合型细胞间或α接合型细胞间能接合形二倍体根据酵母性殖特点文库质粒转化α接合型酵母细胞诱饵表达载体转化a接合型细胞别铺筛选平板使细胞菌苔（lawn）再两种菌苔复印同三重筛选平板原则诱饵靶蛋白发相互作用二倍体细胞才能平板单倍体细胞或虽二倍体细胞BD融合蛋白AD融合蛋白相互作用都淘汰克隆进步通β-半乳糖苷酶力进行鉴定项改进仅简化实验操作且提高双杂交筛选效率
——酵母双杂交系统的发展和应用
随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。
酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域（activationdomain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码AD的基因和CDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了
酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。
基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECHMATCHMarkerSYSTEM3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响
酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。
参考文献
Analysisofsynphilin-1andsynucleininteractionsbyyeasttwohybridb-galactosidaseliquidassay
MichaelNeystata,et.alNeuroscienceLetters325(2002)119–123
Synphilin-1associateswithalpha-synucleinandpromotestheformationofcytosolicinclusions
Engelender,Set.al.Nat.Genet.,22(1999)110–114.
Analysisoftheinteractionbetweensingle-chainvariablefragmentsandtheirantigeninareducingintracellularenvironmentusingthetwo-hybridsystem
GeertDeJaeger,et.al.FEBSLetters467(2000)316^320
Characterisationofinter-andintra-molecularinteractionsofthedenguevirusRNAdependentRNApolymeraseaspotentialdrugtargets
SubhashG.et.al.Farmaco56(2001)33–36
Constructionofamodularyeasttwo-hybridcDNAlibraryfromhumanESTclonesforthehumangenomeproteinlinkagemap
Shao-bingHua,et.al.Gene215(1998)143–152
DevelopingYeastHybridSystem
ZHANG,et.al.ChineseBulletinofLifeSciences12(2000)34-36
Yeasttwo-hybridsystemanditsapplications
ZHANGxiao-guanget.alChineseBulletinofLifeSciences13(2001)228-231
基因快讯
这个直接从生物秀论坛转来的。。。有点。。。你出的力也太少了点吧
THEGFPTWO--HHYBRIDYBRIDSYSTEM.pdf(126.79k)
二、噬菌体展示技术：编码噬菌体外壳蛋白基连接单克隆抗体DNA序列噬菌体表面表达相应单抗再噬菌体柱柱若含目蛋白与相应抗体特异性结合称噬菌体展示技术技术主要用于研究蛋白质间相互作用仅高通量及简便特点具直接基、高选择性筛选复杂混合物、筛选程通适改变条件直接评价相互结合特异性等优点目前用优化噬菌体展示技术已经展示鼠两种特殊细胞系cdna文库并离皮信号传导途径信号
三、等离共振技术：表面等离共振技术(Surface Plasmon ResonanceSPR)已蛋白质相互作用研究新手段原理利用种纳米级薄膜吸附诱饵蛋白待测蛋白与诱饵蛋白结合薄膜共振性质发改变通检测便知两种蛋白结合情况SPR技术优点需标记物或染料反应程实监控测定快速且安全用于检测蛋白核酸及其物间相互作用
四、荧光能量转移技术：荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究间距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合定量获取关物体内蛋白质、脂类、DNA RNA 空信息随着绿色荧光蛋白(GFP)发展FRET 荧光显微镜能实测量体细胞内态性质提种定量测量FRET效率及供体与受体间距离简单仅需使用组滤光片测量比值利用供体受体发射谱消除光谱间串扰该简单快速实定量测量FRET 效率供体与受体间距离尤其适用于基于GFP 供体受体
五、抗体与蛋白质阵列技术：蛋白芯片技术现给蛋白质组研究带新思路蛋白质组研究主要内容研究同理状态蛋白水平量变微型化集化高通量化抗体芯片非研究工具芯片发展快芯片且技术已经益熟些抗体芯片已经向临床应用发展比肿瘤标志物抗体芯片等已经应用再眼各领域
六、免疫共沉淀技术：免疫共沉淀主要用研究蛋白质与蛋白质相互作用种技术其基本原理细胞裂解液加入抗兴趣蛋白抗体孵育再加入与抗体特异结合结合于Pansobin珠金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)若细胞与兴趣蛋白结合目蛋白形种复合物：目蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPAPansobinSPAPansobin比较复合物离离经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳复合物四组经Western blotting用抗体检测目蛋白否预测蛋白种目蛋白细胞内与兴趣蛋白结合符合体内实际情况蛋白信度高种两缺陷：两种蛋白质结合能直接结合能第三者间起桥梁作用;二必须实验前预测目蛋白选择检测抗体所若预测确实验结本身具冒险性
七、pull-down技术：蛋白质相互作用类型牢固型相互作用暂型相互作用两种牢固型相互作用亚基蛋白复合体见通免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western研究Pull-down技术用固相化、已标记饵蛋白或标签蛋白(物素-、PolyHis-或GST-)细胞裂解液钓与相互作用蛋白通Pull-down技术确定已知蛋白与钓蛋白或已纯化相关蛋白间相互作用关系体外传路或翻译体系检测蛋白相互作用关系
用酵母双杂交或是细菌双杂交？
