Our convenient "Mate & Plate” libraries eliminate the time-consuming and labor-intensive cloning and amplification steps required in traditional two-hybrid library manufacturing and screening. These ready-to-go libraries require only simple co-culturing of the MATalpha library strain with your bait-expressing reporter strain (MATa), followed by selection on appropriate minimal medium.
Our convenient "Mate & Plate” libraries eliminate the time-consuming and labor-intensive cloning and amplification steps required in traditional two-hybrid library manufacturing and screening. These ready-to-go libraries require only simple co-culturing of the MATalpha library strain with your bait-expressing reporter strain (MATa), followed by selection on appropriate minimal medium.
Do it yourself, simply and quickly
If our selection of ready-made libraries does not suit your needs, you may wish to Make Your Own Mate & Plate Library just the way we do it. Our system provides the materials and methods you need to create enough library vials for hundreds of yeast two-hybrid screens—in less than a week.
Library creation occurs directly in our Y187 library yeast stain, utilizing the highly efficient homologous recombination machinery of Saccharomyces cerevisiae. There is no need for the labor-intensive library cloning, amplification, and harvesting steps that are required by traditional methods of library construction.
Sensitivity
The system uses SMART cDNA synthesis technology, which allows you to construct cDNA libraries from any tissue source starting with as little as 100 ng of total RNA.
What is SMART technology?
Our SMART technology is based on two specific features of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (MMLV RT):
- Terminal-transferase activity
- Template-switching activity
First-strand cDNA synthesis is primed by a modified oligo(dT) primer or random primers. When the MMLV RT reaches the 5’ end of the mRNA, the enzyme’s terminal transferase activity attaches non-template-directed nucleotides onto the newly synthesized strand of cDNA. Then the chemically modified SMART oligo pairs with the extended tail, and serves as a second template onto which the RT enzyme switches to complete first-strand synthesis.
SMART cDNA synthesis ultimately results in cDNA that contains known universal primer binding sequences at either end. As a result, SMART first-strand cDNA is:
- Available for PCR amplification, enabling you to start from nanogram amounts of RNA, so you can make a library from microdissected tissues, laser-captured cells, biopsy samples, etc.
- Homologous to the ends of the Matchmaker Gold prey plasmid, pGADT7-Rec; the library is created by cotransforming the yeast strain Y187 with pGADT7-Rec and the SMART cDNA.
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双杂交系统另重要元件报道株报道株指经改造、含报道基(reporter gene)重组质粒宿主细胞用酵母细胞 酵母细胞作报道株酵母双杂交系统具许优点: 〈1〉 易于转化、便于收扩增质粒〈2〉具直接进行选择标记基特征性报道基〈3〉酵母内源性蛋白易同源于哺乳物蛋白结合激结构域融合基转入表达结合结构域融合基酵母细胞系 蛋白间作用使转录重建导致相邻报道基表达(lacZ) 析蛋白间结合作用
酵母双杂交系统能体内测定蛋白质结合作用 具高度敏性主要由于:①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达②信号测定自平衡浓度条件进行 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤降低信号强度③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强 者与启DNA结合 三元复合体使其各组结合趋于稳定④通mRNA产种稳定酶使信号放同 酵母表型 X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏图" class="ikqb_img_alink">
最近本人在做一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的酵母双杂交,想吊出它的互作基因,前段时间用Invitrogen的PROQUESTTWO-HYBRIDSYSTEM筛过一次库,没有得到任何阳性克隆,我估计是连入载体的基因太长有3KB多,1000多个氨基酸,可能就算表达出来了也不能行使正常功能。随后取了蛋白的激酶区1.8KB,想重新筛一次库(还未开始重筛)。后来老板的建议是要我试试酵母细胞质双杂交系统,因为在生物体内,我所研究的蛋白是在细胞质中表达的,可能在酵母细胞核中也不能正常工作(猜测)。
这两天我查了查,发现细胞质的双杂交完全不同,要是做的话还有重新购买另外的试剂盒,重新构建文库。
还有一点就是,前人发表的文章,同样是做我这种蛋白激酶的,都是用传统的酵母双杂交系统筛选到互作蛋白的,如果情况是这样的话我是否还有必要尝试细胞质的双杂交呢?
还是等我做了激酶区的筛库之后再说?
请各位帮忙看看,谢谢。
二、噬菌体展示技术:编码噬菌体外壳蛋白基连接单克隆抗体DNA序列噬菌体表面表达相应单抗再噬菌体柱柱若含目蛋白与相应抗体特异性结合称噬菌体展示技术技术主要用于研究蛋白质间相互作用仅高通量及简便特点具直接基、高选择性筛选复杂混合物、筛选程通适改变条件直接评价相互结合特异性等优点目前用优化噬菌体展示技术已经展示鼠两种特殊细胞系cdna文库并离皮信号传导途径信号
三、等离共振技术:表面等离共振技术(Surface Plasmon ResonanceSPR)已蛋白质相互作用研究新手段原理利用种纳米级薄膜吸附诱饵蛋白待测蛋白与诱饵蛋白结合薄膜共振性质发改变通检测便知两种蛋白结合情况SPR技术优点需标记物或染料反应程实监控测定快速且安全用于检测蛋白核酸及其物间相互作用
四、荧光能量转移技术:荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究间距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合定量获取关物体内蛋白质、脂类、DNA RNA 空信息随着绿色荧光蛋白(GFP)发展FRET 荧光显微镜能实测量体细胞内态性质提种定量测量FRET效率及供体与受体间距离简单仅需使用组滤光片测量比值利用供体受体发射谱消除光谱间串扰该简单快速实定量测量FRET 效率供体与受体间距离尤其适用于基于GFP 供体受体
五、抗体与蛋白质阵列技术:蛋白芯片技术现给蛋白质组研究带新思路蛋白质组研究主要内容研究同理状态蛋白水平量变微型化集化高通量化抗体芯片非研究工具芯片发展快芯片且技术已经益熟些抗体芯片已经向临床应用发展比肿瘤标志物抗体芯片等已经应用再眼各领域
六、免疫共沉淀技术:免疫共沉淀主要用研究蛋白质与蛋白质相互作用种技术其基本原理细胞裂解液加入抗兴趣蛋白抗体孵育再加入与抗体特异结合结合于Pansobin珠金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)若细胞与兴趣蛋白结合目蛋白形种复合物:目蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA|PansobinSPA|Pansobin比较复合物离离经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳复合物四组经Western blotting用抗体检测目蛋白否预测蛋白种目蛋白细胞内与兴趣蛋白结合符合体内实际情况蛋白信度高种两缺陷:两种蛋白质结合能直接结合能第三者间起桥梁作用;二必须实验前预测目蛋白选择检测抗体所若预测确实验结本身具冒险性
七、pull-down技术:蛋白质相互作用类型牢固型相互作用暂型相互作用两种牢固型相互作用亚基蛋白复合体见通免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western研究Pull-down技术用固相化、已标记饵蛋白或标签蛋白(物素-、PolyHis-或GST-)细胞裂解液钓与相互作用蛋白通Pull-down技术确定已知蛋白与钓蛋白或已纯化相关蛋白间相互作用关系体外传路或翻译体系检测蛋白相互作用关系
发展起各种双杂交系统Fields等建立系统基础些新系统主要报道基、诱饵表达载体及猎物表达载体等做些改进其重要改进引入额外报道基广泛采用HIS3基经改造带HIS3报道基酵母细胞HIS3启表达才能缺乏组氨酸选择性培养基HIS3报道基转录表达由诱饵猎物相互作用所启数双杂交系统往往同使用两甚至三报道基其 LacZ些改造基启区相同转录激结合位点相同转录激(述Gal4蛋白)激通种双重或重选择既提高检测灵敏度减少假阳性现象其针诱饵或猎物表达载体等所作改进详述
双杂交鉴定程要经两转化工作量相特别寻找新作用蛋白质候尤其且酵母细胞转化效率比细菌要低约4数量级转化步骤双杂交技术瓶颈Bendixen等通酵母接合型引用避免两转化操作同提高双杂交效率酵母性殖程涉及两种配合类型:a接合型α接合型两种单倍体间接合(mating)能形二倍体a接合型细胞间或α接合型细胞间能接合形二倍体根据酵母性殖特点文库质粒转化α接合型酵母细胞诱饵表达载体转化a接合型细胞别铺筛选平板使细胞菌苔(lawn)再两种菌苔复印同三重筛选平板原则诱饵靶蛋白发相互作用二倍体细胞才能平板单倍体细胞或虽二倍体细胞BD融合蛋白AD融合蛋白相互作用都淘汰克隆进步通β-半乳糖苷酶力进行鉴定项改进仅简化实验操作且提高双杂交筛选效率
SOSRAS募集系统 (SRS and RRS)Ras信号通路转录旁路(are bypassing the transcriptional readout by using the Ras signalling pathway)酵母细胞哺乳物相似Ras定位质膜通酵母Cdc25或哺乳物Son of sevenless (SOS)脒基交换进行GDP-GTP转换Ras激引发游信号转导途径处描述Y2H系统使用Cdc25-2温度敏型酵母菌株Cdc25-2没性能激Ras信号转导途径导致菌株高温(36 ℃)能通Y2H系统选择性激Ras使其温度敏表型消失
SCINEX-P系统(胞外蛋白间互作筛选)由Urech等于2003发布使我析ER内氧化环境蛋白互作该系统利用酵母未折叠蛋白反应(UPR)信号途径ER错误折叠蛋白积累诱导酵母ER I类跨膜蛋白(Ire1p)形二聚体者诱导Hac1p转录其产物激伴侣转录SCINEX-P系统目蛋白与缺少位于腔内N末端寡聚化结构域Ire1p突变蛋白(ΔIre1p)融合两种杂合蛋白互作引起Ire1p蛋白二聚体重构激UPR游信号转导程检测蛋白互作Hac1p UPR元件引入报告基启Y2H系统功用于析蛋白质二硫键异构酶ERp57与钙联蛋白间(两蛋白都ER折叠)、抗原与抗体间互作
裂化泛素系统由JohnssonVarshavsky于1994设计用于测定细胞质基质蛋白间互作检测;扩展膜蛋白间互作筛选泛素类蛋白于细胞错误折叠蛋白十重要蛋白通与聚泛素蛋白链共价结合标记蛋白酶体降解象该链泛素特异性蛋白酶(USP)首先蛋白降解裂泛素化Y2H技术基于泛素裂两独立片段已研究显示泛素裂N端(Nub)及C端(Cub)并且片段间亲性能自发形与原泛素类似蛋白通Nub(NubG, NubA)点突变(I13G or I13A )使NubCub自发组装进行
两种突变体两部由于NubG/ACub互作拉足够接近距离才能发效结合重构裂化泛素USPs识别切掉与Cub C端融合报告蛋白初系统使用二氢叶酸原酶作报告基者产物通SDS-PAGE检测由于需要使用免疫共沉淀电泳离阳性克隆鉴定十便
膜反式转录激裂泛素(MbY2H)系统使用工转录(LexA-VP16)作与泛素相连水解报告蛋白析ER膜蛋白间相互作用旦泛素重组LexA-VP16释放核并激报告基转录(HIS3LacZ)种转录激式放蛋白互作反应瞬互作检更敏、更便系统已功用于检测同种类膜蛋白间互作反应裂泛素系统已广泛应用于cDNA文库筛选规模矩阵
近期改进适用于胞质蛋白互作筛选MbY2H系统已发布改进案诱饵载体包括Cub转录并且由于融合ER膜蛋白Ost4p使融合蛋白锚定ER膜图" class="ikqb_img_alink">
主要由于:
①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达
②信号测定自平衡浓度条件进行 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤降低信号强度
③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强者与启DNA结合 三元复合体使其各组结合趋于稳定
④通mRNA产种稳定酶使信号放同 酵母表型 X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏图" class="ikqb_img_alink">