实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1.使用标准的亚克隆技术，将编码诱饵蛋白的DNA插入PEG202的多克隆位点构建诱馆质粒（pBait）。

2.按照乙酸锂酵母转化法用pBait和pSH18-34（lacZ报道载体）转化相互作用阱筛选酵母株（EGY48）。

3.将转化株涂布到Glu／CM-His、-Ura平板上，放置于30℃培养箱中。

4.进行lacZacZ激活和亮氨酸需求平板检测以确保诱饵蛋白不会自己激活报道基因。

5.用阻遏测试法确定诱饵蛋白的合成。

6.将转化的EGY48（步骤3）接种到20mlGlu／CM-His、-Ura液体培养基，于30℃振荡过夜。

7.测量OD₆₀₀吸光值，在250mlGlu／CM-His、-Ura培养基中稀释至5×10⁶细胞／ml。0.1的OD₆₀₀相当于大约3×10⁶细胞／ml。这个数值应当在每个应用的酵母株得到确认。

8.于30℃振荡培养细胞至OD₆₀₀为0.6～0.8（约5～6h）。

9.将培养液分为5个50ml圆锥形离心管中，室温下于3000g离心5min。

10.弃上清，将酵母沉淀重悬于25ml无菌水中，重复离心。

11.弃上清，将酵母沉淀重悬于1ml100mmol／L乙酸锂中。移到一1.5ml微量离心管中，室温下20800g离心15s沉淀酵母。

12.吸去上清，重悬酵母于350ul100mmol／L乙酸锂中（终体积约500ul）。

13.将每个管中的溶液分为10个50ul，室温下20800g离心15s沉下酵母。

14.吸去上清，依次加入下列成分：

240ul50％（m／V）PEG3350

36ul1mol／L乙酸锂

50ul2mg／ml单链载体DNA（100ug）

25ul40ug／ml肽适配体库DNA（1ug）。

在使用前，单链载体DNA需要加热到95℃放置5min，然后放冰上冷却。

15.剧烈振荡转化混合物直至酵母沉淀完全重悬起来，然后于30℃孵育30min。

16.于42℃热激20min。

17.室温下20800g离心15s沉下酵母。

18.吸去上清，重悬酵母于500ul无菌水中。

19.将48个转化株分别涂布到单独的15cmGlu／CM-His、-Ura、-Trp平板上。

20.两个剩下的转化株各取400ul涂布到15cmGlu／CM-His、-Ura、-Trp平板上。

21.用剩下的100ul测定转化效率。用水进行一系列10倍的稀释，然后涂布到10cmGlu／CM-His、-Ura、-Trp平板上。

22.于30℃孵育2～3天（直至克隆的直径约为1mm）。

23.将50个转化平板上的酵母（步骤19、20）收集到的一个50ml的离心管中。

24.加入等体积的2×甘油存储液到收集的酵母细胞中。分装为1ml的小份并存储于-70℃。

25.检测冻存的小份酵母的平板效率。

26.接种肽适配体库的10个库等价物到2mlGal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp液体培养基中。于30℃振荡培养4h。一个库等价物等于含有肽适配体库的酵母转化株的总数，如步骤21所检测的。

27.室温下于3000g离心4min。

28.吸去上清，重悬酵母于1ml无菌水中。

29.将酵母以10⁶个酵母细胞／平板的密度涂布到15cmGal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp、-Leu的平板上。

30.于30℃培养，每天观测平板生长情况。

31.将克隆划线接种到10cmGlu／CM-His、-Ura、-Trp的主平板上。于30℃培养1～2天。

32.将主平板在下列指示平板上复制：

Glu／CM-His、-Ura、-Trp、-Leu

Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp、－Leu

Glu／CM-His、-Ura、-Trp、X-gal

Gal／Raf／CM-His、-Ura、-Trp、X-gal

33.鉴定出在-Leu平板上呈半乳糖生长依赖性并且在X－gal平板上呈半乳糖依赖的蓝色的克隆。

34.提取所需的肽适配体表达质粒。

35.以质粒为模板，对肽适配体的可变区进行测序。

36.为了从pBait和pSH18－34中分离出适配体质粒，转化E.coli并用扩增硫氧还蛋白的引物通过PCR鉴定出正确的转化株。