【求助】能否在普通PCR仪上摸索realtimePCR反应条件？
2021-07-28
问题描述：
由于自己实验室没有realtime-PCR的仪器，所以要到别的实验室做，但是每次操作的费用比较高，而自己的实验室有普通PCR的仪器，所以我想问下我能否在普通的PCR上用realtime-PCR的试剂（SYBRgreen）和引物先摸索合适的反应条件，然后再应用到realtime-PCR的仪器中？如果可以需要注意哪些方面呢?非常感谢！:)
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sammyliang
用户
找到最适合的退火温度即可，可以用普通pcr仪摸索。上机的时候要注意你用sybr green是谁家的，不同的家程序不同，如abi金牌酶。
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好小猫
用户楼主可怜，想起以前我做实验时的可怜情境了。可以的，加入染料扩增，普通电泳检测，条件摸好后，上real-time试一下，问题不大就直接用，或者微调一下，一般没问题的
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leomed
用户我之前有用普通的pcr试剂试P过，条带很亮的，但是我今晚用sybrgreen（Takara公司的）试做了下，条件是按说明书上的，结果条带有，但是很模糊，不过我凝胶没加EB，不懂是不是这个原因，我原来是想sybrgreen也是在DNA双链合成时嵌入进去的，而EB也是嵌入双链中，用了sybrgreen是不是EB就没法嵌入了，所以没加EB，而sybrgreen本身也是荧光，是否这样？
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JIAOYUE
用户虽然染料中有SYBR，但是最好在凝胶中也使用EB进行染色。
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sammyliang
用户eb是结合dna大沟，sybergreen结合dna小沟，灵敏度后者高出很多啊。
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好小猫
用户楼上几位说了，就不在赘述了
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leomed
用户各位大侠，请问你们有这样做过么，效果如何？有个问题，realtime-PCR在做完扩增曲线后就直接做溶解曲线了，而在普通PCR仪上最后一个循环完成后参数是怎么设置呢，直接转4度还是？
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dyhvs
用户一般都加一个终延伸的，同循环中的延伸温度，只是时间加长。
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leomed
用户虽然没在普通PCR仪上得到好的结果，不过很感谢各位战友的帮助，而且很高兴的是已经在realtime-PCR仪上摸好反应条件了。
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yaxiao_999
用户我也是楼主一样的条件，可以在普通的机子上摸索一下，但到定量上还是要调一下
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