| 实验材料 | 复杂蛋白混合物 试剂、试剂盒 | 生物素化试剂生物素化胰酶消化缓冲变性缓冲液变性还原缓冲液二硫苏糖醇（DTT)甲酸碘乙酰胺PBS胰酶 仪器、耗材 | CentriconYM-3冷冻离心机免疫纯化的固定化抗生物素亲和柱OasisHLB抽提柱真空干燥器 实验步骤 | 一、变性、还原和缓冲液置换1.在真空干燥器中浓缩120ug混合蛋白样品，直至完全干燥。 2.将蛋白样品重新溶解在约1ml变性/还原缓冲液中，37°C孵育30min，使样品变性还原。 体积不掃要非常精确，因为在下一步操作中缓冲液还需置换。不过样品体积越小，需要置换的时间就越短。 3.除去还原剂，降低尿素浓度以及除去缓冲液中的干扰成分。用约4ml生物素化/胰酶消化缓冲液置换原液，在CentriconYM-3浓缩管中进行（4°C离心）。 二、标记Biotin-HPDP和缓冲液置换4.标记所有自由巯基。加入50ul4mmol/LBiotin-HPDP(溶于DMSO中）到样品中（第③步操作后样品体积约为1ml)，室温孵育标记混合物90min。 由于不确定标记反应是否能在2mol/L尿素存在的情况下有效进行,所以可加人过量的Biotin-HPDP。Biotin-HPDP的量应大于亲和柱的结合能力（理论上，Img抗生物素蛋白可结合59nmol的生物素）。 5.用新鲜的生物素/胰酶消化缓冲液置换原液，以除去未结合的Biotin-HPDP。 置换在CentriconYM-3浓缩管中进行（4°C离心）。 未结合的Biotin-HPDP会与生物素化的多肽竞争结合抗生物素蛋白。 第③步用过的CentriconYM-3浓缩管可在这一步重复使用。 三、标记后蛋白混合物的消化6.加1.5ug胰酶到生物素化的样品中，孵育消化过夜（37°C)。 7.用PBS(含1mmol/LEDTA)稀释样品消化产物，使尿素浓度降到0.5mol/L以下。 如果在几个小时内就用于抗生物素亲和柱，样品则可以在室温、4°C或冰冻保存。若需要留存更长时间，则保存在-80°C。 四、固定化抗生物素亲和柱捕获及洗脱8.用5mlPBS(含lmmol/LEDTA)平衡1ml固定化抗生物素亲和柱。 9.将消化后的样品（来自第⑦步）加到亲和柱上，封闭亲和柱，室温孵育30min。注意不要让柱子变干。 10.为收集不含半胱氨酸的多肽，用10mlPBS(含1mmol/LEDTA)淋洗柱子，并收集洗脱液。这样可获得穿透组分。 11.从固定化抗生物素亲和柱上洗脱含半胱氨酸的多肽。 （1）加2ml含50mmol/LDTT(现用现加）的PBS到柱子上，使其进入柱子。 （2）封闭柱子，室温孵育30min。 （3）打开柱子，收集2ml洗脱液，得到结合组分。 五、烷基化和除盐12.如果要进行LC-MS/MS分析，需用IAA(分别为10mmol/L和100mmol/L)对穿透组分和结合组分分别进行烷基化，避光室温作用30min。 13.用90%甲酸酸化肽段（分别加20沁到结合组分，IOOiLd到穿透组分），使甲酸终浓度为1%。在脱盐前一直将样品保存在-80°C。 14.根据厂商提供的使用说明，在LC-MS/MS之前用OasisHLB抽提柱（或类似设备）对各个组分进行脱盐。 |
|---|
