【求助】Ni柱使用过程中磷酸钠缓冲液配制的问题

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2014-10-12

问题描述：

看了GE公司的NiSephrose6FastFlow说明书，说bindingbuffer建议20mMsodiumphosphate,0.5MNaCl,pH7.4,elutingbuffer中是在bindingbuffer中加了高浓度的咪唑，我想问一下，这个怎么配制啊？那个sodiumphosphate是什么？磷酸钠溶液？貌似不具有缓冲性，磷酸钠缓冲液？有可能，但是这个咋配啊？有我能想到的三个配制方法，想求助一下;
1.直接用固体磷酸钠配制成50mM的磷酸钠溶液，再调pH到7.4；（我们试着用这个做了下，发现挂不上柱）
2.配置磷酸钠盐缓冲液：按NaH2PO4：Na2HPO4以19：81的摩尔比配制成pH7.4的缓冲液？（附一张百度出来的配方
）

3.如果是磷酸钠盐缓冲液，可以直接将50mM的NaH2PO4的水溶液用NaOH调成pH7.4吗？
再者，2和3这两个方法配制的磷酸钠盐缓冲液有什么区别？最终效果是一样的吗？如果不一样，有什么理论的知识支撑呢？个人感觉是分析化学中酸碱理论中的缓冲液那里的知识。求帮忙解答这些疑问。
另外，我还想问一下，pH对于Ni柱对His-tagged的蛋白的分离纯化影响大吗？是怎么影响的？谢谢大家了！

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高展远瞩

用户

在网上找的的Ni-NTA亲和层析原理：① Ni-NTA：琼脂糖或者其他基质共价连接NTA基团，NTA基团与Ni形成四价螯合物，并留下Ni两价用于与其他基团结合。同样作用的还有IDA基团，但NTA相对比较耐还原剂，因此使用较多。② 组氨酸（His）的R基上带有1个咪唑基团，咪唑基团pKa值在6左右，在pH＞7的条件下，咪唑基团带负电，容易与Ni离子结合。③ 因此通过Ni-NTA吸附住的蛋白可以使用咪唑、组氨酸、或者其他含N化合物进行竞争洗脱，也可以通过降低pH值使咪唑基团带正电从而洗脱蛋白。④ NI-NTA上的Ni可以通过EDTA进行螯合竞争洗脱下来。⑤ 同样的道理，其他过渡金属离子如Cu2+、Co2+等也能起到和Ni一样的作用，但是相比来说，Ni不容易引起蛋白变性。所以Ni柱较为常用。⑥ 除了组氨酸外，还有一些氨基酸残基如半胱氨酸等也能与金属结合，但结合力比起组氨酸来说较弱。可以通过加入NaCl等消除这种吸附。

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高展远瞩

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展开引用高展远瞩在网上找的的Ni-NTA亲和层析原理：①Ni-NTA：琼脂糖或者其他基质共价连接NTA基团，NTA基团与Ni形成四价螯合物，并留下Ni两价用于与其他基团结合。同样作用的还有IDA基团，但NTA相对比较耐还原剂，因此使用较多。②组氨酸（His）的R基上带有1个咪唑基团，咪唑基团pKa值在6左右，在pH＞7的条件下，咪唑基团带负电，容易与Ni离子结合。③因此通过Ni-NTA吸附住的蛋白可以使用咪唑、组氨酸、或者其他含N化合物进行竞争洗脱，也可以通过降低pH值使咪唑基团带正电从而洗脱蛋白。④NI-NTA上的Ni可以通过EDTA进行螯合竞争洗脱下来。⑤同样的道理，其他过渡金属离子如Cu2+、Co2+等也能起到和Ni一样的作用，但是相比来说，Ni不容易引起蛋白变性。所以Ni柱较为常用。⑥除了组氨酸外，还有一些氨基酸残基如半胱氨酸等也能与金属结合，但结合力比起组氨酸来说较弱。可以通过加入NaCl等消除这种吸附。......这里应该可以说明pH对于Ni柱挂柱和洗脱是有影响的。pH>7,咪唑带负电，易与Ni2+结合；降低pH可使咪唑带正电从而洗脱。另外我还看了GE的Ni柱说明书，说pH低于4以后，Ni离子会从中脱落也可以导致洗脱。

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