核酸定量分析DNA或RNA(以260nm处的吸光值为基础)1.制备用蒸馏水稀释过的DNA或RNA样品溶液(典型稀释比为1:100或5:500μl)2.使用紫外光源,在260nm处测定吸光值,也可以在280nm和230nm测定吸光值(260/280的光吸收值比粗略为2/1；260/230的光吸收值比也应接近2/1)3.计算原液浓度:A260x转化系数x稀释率=DNA原始浓度(μg/ml)光吸收值单位双链DNA的转化系数是50μg/ml；单链DNA和RNA的转化系数是40μg/ml平均的脱氧核苷酸(碱基)分子量是326.95，因此，平均的碱基对的分子量是753.9。为便于计算，这个值的单位可以用微摩尔，比如下面的例子:(2xμgDNA)+[753.9x(双链DNA的碱基对数)]因此，1μg的pUCDNA就等于2x1μg+[753.9μg/μmolbpx2676bp]或2μg+2017436.4μg/μmol=1x10-6μ摩尔寡核苷酸1.寡核苷酸的消光系数(∈)的计算:a.将碱基A、C、G和T的出现次数用表格统计出来b.乘以如下数值:A的次数x15.4ml/µmoleC的次数x7.3ml/µmoleG的次数x11.7ml/µmoleT的次数x8.8ml/µmolec.这些结果的总和就是消光系数，∈2.测定寡核苷酸溶液在260nm的吸光值3.用下列公式计算浓度:浓度=A260÷∈(注:μmol/ml=mM)NB.购买的寡核苷酸通常是冰冻干粉的形式，以O.D.值为计量单位。一个O.D.单位相当于这一个样品在1毫升中(初略)重悬浮后的A260值。用上述公式，此数据即可用来估测寡聚核苷酸在这种溶液中的浓度，以这个数据为基础，可以准备更合适的寡聚物的浓度。例如：一个寡核苷酸的∈为262.9ml/µmole，现在有一3O.D.的寡核苷酸；因此，1ml的溶液的浓度可达262.9ml/µmole=11.4μM，那么要获得一20μM的溶液，由于C1V1=C2V2:1mlx11.4µM=?x20µM；(1mlx11.4µM)/20µM=0.570ml.需将此液在570µl中重悬浮!©P.Lessard2002,保留所有权利。
