细胞冻存液氮罐使用及维护标准操作程序
| 实验方法原理 | 此方案中cDNA的合成是在4种饱和浓度的dNTP及一种痕量的放射性标记的dNTP中进行的。扣除杂交后，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段作用下，富集的单链cDNA通过随机寡核苷酸引物延伸的二次合成反应，标记成高比活性的探针。由于第一轮反应中dNTP的浓度为非限制性的，所生成cDNA的量及大小均高于标准方案，因此扣除杂交步骤以高效进行。由此产生的cDNA群体不易受辐射分解的破坏，从而可长期贮存，必要时尚可标记成较高比活性的探针。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段反转彔酶随机脱氧核苷酸引物模板mRNA 试剂、试剂盒 | 二硫基苏糖醇乙醇EDTANaOH胎盘RNA酶抑制剂随机引物缓冲液醋酸钠dNTP溶液 仪器、耗材 | SephadexG-50离心柱微量离心管水浴 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 二硫基苏糖醇（DTT)(1mol/L） EDTA(0.5mol/L，pH8.0) 乙醇 HCl(2.5mol/L) NaOH(3mol/L) 酚：氯仿（1:1，V/V) 胎盘RNA酶抑制剂 5X随机引物缓冲液（250mmol/LTris(pH8.0)，25mmol/LMgCl2，100mmol/LNaCl，10mmol/LDTT，1mol/LHEPES(用4mol/LNaOH调至pH6.6)，使用1mol/LDTT贮存液的新稀释水溶液，贮存于-20℃。用后弃去稀释的DTT。） SDS(20%m/V) 醋酸钠（3mol/L，pH5.2) Tris-Cl(1mol/L，pH7.4) 2.酶与缓冲液 大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段 反转彔酶 10X反转录酶缓冲液 3.核酸与寡核苷酸 含4种dNTP各5mmol/L的（完全）dNTP溶液 含dCTP、dGTP和dTTP各5mmol/L的dNTP溶液 oligo(dT)12-18 长度为6或7个碱基的随机脱氧核苷酸引物 模板mRNA 4.放射性复合物 [α-32P]dATP(10mCi/ml，比活性为>3000Ci/mmol） [α-32P]dCTP(10mCi/ml，比活性为800~3000Ci/mmol） 5.专用设备 SephadexG-50离心柱，平衡于TE（pH7.6) 硅化的微量离心管（1.5ml） 预热至45℃、60℃和68℃的水浴 二、方法 1.4℃下在一个灭菌的微量离心管中混合下列成分以合成cDNA第一链： 模板RNA(1mg/ml） 10μl oligo(dT)12-18（1mg/ml） 10μl 5mmol/LdNTP（完全）溶液 10μl 50mmol/LDTT 1μl 10X反转录缓冲液 5μl 10mCi/ml[α-32P]dCTP 5μl (比活性800或3000Ci/mmol） 胎盘RNA酶抑制剂 25单位 无RNA酶的水 加至46μl 反转录酶（~800单位） 4μl 2.检测放射性标记的dNTP掺入TCA可沉淀物或结合于DE-81滤膜的比率。用下列公式计算cDNA第一链的产率。  3.加入下列试剂以终止反应： 0.5mol/LEDTA(pH8.0) 2μl 20%(m/V)SDS 2μl 充分混匀微量管中的各成分。 4.在反应管中加入5μl3mol/LNaOH，于68℃温育反应30min以水解RNA。 5.将反应物温度冷至室温。加入10μl1mol/LTris-Cl(pH7.4)，充分混匀以中和溶液，然后加5μl2.5mol/LHCl。点一小滴溶液（<1μl）在pH试纸上以检测溶液的pH。 6.用酚:氯仿抽提纯化cDNA。 7.用SephadexG-50离心柱层析分离放射性标记的探针与未掺入的dNTP。 8.进行两轮扣除杂交。 9.用异丁醇序贯抽提浓缩cDNA，通过SephadexG-50层析除盐。 10.用标准乙醇沉淀回收cDNA。将cDNA溶于水，终浓度为15ng/μl。 11.为了对扣除cDNA进行高比活性的放射标记，在一个0.5ml微量离心管中混合下列成分： 扣除cDNA 5μl 随机脱氧核苷酸引物（125μg/ml） 5μl 12.加热混合物至60℃5min，然后冷却到4℃。 13.向引物：cDNA模板混合物中加入： 5X随机引物缓冲液 10μl 含dCTP、dGTP和dTTP 各5mmol/L的dNTP溶液 5μl 10mCi/ml[α-32P]dATP (比活性为>3000Ci/mmol）25μl Klenow片段（12.5单位） 2.5μl 水 加至50μl 室温下反应4~6h。 14.加入下列试剂以终止反应： 0.5mol/LEDTA(pH8.0) 1μl 20%(m/V)SDS 2.5μl 15.用SephadexG-50离心柱层析分离放射性标记的cDNA与未掺入的dNTP。 |
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发布于 ： 2019-02-20
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