医用治疗设备(医用设备)
| 实验材料 | 大肠杆菌 试剂、试剂盒 | PEGTEATP寡核苷酸诱变引物T4多核苷酸激酶EDTASSC 仪器、耗材 | 水浴锅电泳仪培养箱 实验步骤 | 1. 将一个单链噬菌体产生的噬斑转移至含有1ml灭菌TY培养基的1.5ml微量离心管中，60℃温育5min，以杀灭细菌细胞，剧烈振荡以释放琼脂中的噬菌体，离心2min。 2. 将100μl上清转移至1L的烧瓶，瓶中装有100ml培养基，其中含0.25μg/ml的尿苷。 3. 加5ml处于对数生长中期的大肠杆菌培养液，于37℃剧烈振摇培养6~18h。 4. 以5000g离心30min，保留上清。 5. 确定噬菌体在ung-大肠杆菌对ung+大肠杆菌中的相对滴度。 4. 毎4体枳的上清加1体积的5×PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌体，混匀，0℃温育1h。 6. 5000g离心15min，倒弃上清，在15mlCorex管内用5mlTE缓冲液溶解沉淀，在旋涡混合器上剧烈振荡。 7. 将噬菌体溶液置冰上1h，如上步再次离心以去除细胞碎片，再用酚抽提和乙醇沉淀单链噬菌体DNA，通过测260nm吸光值确定DNA浓度。 8. 在1.5ml微量离心管内加入下列试剂： （1）20μl 10×T4多核苷酸激酶缓冲液 （2）2μl 10mmol/lATP （3）突变的寡核苷酸（长15~20个核苷酸〉 （4）加水至20μl （5）2U T4多核苷酸激酶 （6）37℃温育60min，加3μl100mmol/lEDTA并加热至70℃终止反应。 9. 加含尿嘧啶的单链环状DNA模扳（通常为1μgDNA溶解在1μl体积）至磷酸化的寡核苷酸中，加1.25μl20×SSC，充分混匀，离心5s。 10. 将离心管放入一个盛有70℃水的500ml烧杯中，自然冷却至室温后离心5s，置于冰上。 11. 加入下列试剂以形成杂交混合液： （1）20μl 5×聚合酶混合物 （2）2.5U或T4DNA聚合酶 （3）2UT4DNA连接酶 （4）加水至100μl （5）充分混匀，然后置于0℃5min，室温5min，37℃2h。 （6）最后加3μl500mmol/lEDTA终止反应。 12. 取20μl 在0.8%的琼脂糖上电泳。对照泳道应包括单链环状病毒DNA，双链闭环DNA和带切口的双链坏状DNA。 13. 根据电泳结果估算DNA的量，用1~100ng的双链DNA产物转化ung+大肠杆菌。 14. 选择性地或随机挑取所得克隆（噬斑或菌落）用以分离纯的克隆原种。 15. 通过DNA序列测定对选出的克隆进行分析。 |
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发布于 ： 2019-03-04
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