产品内容
组分 | A6079S (10T) | A6079M (50T) | A6079L (100T) |
A. 1×Annexin V 结合缓冲液 | 10 mL | 50 mL | 50 mL×2 |
B.Annexin V-PE | 50 μL | 250 μL | 500 μL |
C. RedNucleus II | 100 μL | 500 μL | 1 mL |
储存条件4℃避光冷藏,请勿冻存。有效期见外包装。Annexin V-PE 储存于50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1% BSA, 0.02% NaN3,pH 7.4 的溶液中。光谱特性Annexin V-PE:Ex/Em=488/578 nmRedNucleus II:Ex/Em=635/695 nm产品介绍
UE-A6079S/A6079M/A6079L1. 凋亡时间处理过长,使细胞全部死亡。建议重新摸索细胞凋亡条件,使细胞处于不同的凋亡状态。2. 对于贴壁细胞,胰蛋白酶消化时间过长或机械刮擦细胞会暂时破坏质膜,使Annexin V能够与细胞膜胞内面上的磷脂酰丝氨酸结合,导致假阳性染色。建议在胰蛋白酶消化或机械刮擦细胞后,让细胞在最佳细胞培养条件和培养基中培养约30分钟,以恢复其膜完整性。◆实验结果使用什么仪器观察?实验结果可以通过流式细胞仪和荧光显微镜进行观察,但更推荐使用流式细胞仪。因为正常的细胞和凋亡的细胞膜上都有磷脂酰丝氨酸(PS),只是凋亡细胞膜外更多,可以结合更多的Annexin V,流式细胞仪更灵敏,可以区分出微小差异,将正常细胞与凋亡细胞分成不同的两群,但如果用荧光显微镜,可能观察不到这一差别,尤其是贴壁细胞。若要在成像测定中检测细胞凋亡,推荐使用SuperView™ 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells。◆流式细胞仪检测细胞凋亡,结果图中的各个象限代表什么状态的细胞?左上角:Annexin V-/PI+,机械损伤细胞;右上角: AnnexinV+/PI+,晚期凋亡细胞或坏死;右下角:AnnexinV+/PI-,早期凋亡细胞;左下角:AnnexinV-/PI-,正常细胞。◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗?不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸,包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA,由于RNA的干扰,用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时,凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。 如果需要进行细胞周期检测,推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit(C6031)◆各象限代表的细胞状态问题?Q1:(AnnexinV-染料)-/PI+,此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中,甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多,实验结果越不可信,建议实验中尽量控制这一象限细胞比例。Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+,此区域的细胞为晚期凋亡细胞或坏死。Q3:(AnnexinV-染料)+/PI-,此区域的细胞为早期凋亡细胞。Q4:(AnnexinV-染料)-/PI-,此区域的细胞为活细胞。

◆假阳性问题?
1. 消化液中含有EDTA或消化时间过长引起的假阳性。Annexin V和PS的结合需要Ca2+,而EDTA是Ca2+螯合剂,使用含有EDTA的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长,吹打细胞要轻柔,因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤,造成假阳性。细胞消化下来后,建议在培养箱中在孵育30min,使细胞膜恢复完整性,避免假阳性,或者将细胞报讯在含2% BSA的PBS中,防止进一步的损伤。2. 如果样品来源于血液,必须去除血液中的血小板,因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,干扰实验结果。建议:可以含有EDTA的缓冲液200g离心去除血小板, 最后细胞多洗几遍,减小EDTA螯合钙离子产生的影响。3. 神经细胞膜容易破坏外翻,导致假阳性,所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。4. 诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡,因此通常不需要处理大于48小时以上,诱导时间过长会使营养物质耗尽,导致细胞状态差,假阳性结果偏高。◆荧光染料选择的问题?1. 实验样本是否带荧光,因为感染病毒或质粒转染的细胞往往带GFP荧光,GFP与YF488/FITC通道重叠,不能选择YF488/FITC标记的Annexin V,此时如果只有488 nm一根激光管可以用PE标记Annexin V,用7-AAD代替PI,若有633 nm激光管,可以改用YF647 Annexin V代替YF488。2. 如果流式细胞仪带有488 nm和633 nm两个或以上激光管,首先考虑用APC或YF647标记 Annexin V,因为它和PI通道几乎不用考虑光重叠问题,可以减少调节补偿的烦恼,如果只有488 nm激光管则可选择YF488/FITC标记的Annexin V。3. 处理因素是否带有荧光,本实验室就碰到过一个促凋亡药物Doxorubicin本身发红色荧光,对PI通道的检测造成严重干扰,而且浓度越大干扰越明显。这时建议选用A6079或Y6102 。◆圈门问题?1.要特别注意在FSC/SSC圈门时,所选细胞范围会对结果造成较大影响,所以在分析数据时,要把所有细胞都圈进FSC/SSC的门内,这样实验结果才会更可信。如图,使细胞群大概位于对角线上,并且细胞群较集中,群内细胞比例要在80%以上,如果细胞全部圈入,细胞比例才50%或者更低,说明细胞被压在了坐标轴上,这时要重新调节FSC和SSC。2.贴壁细胞做Annexin V凋亡检测,通常分群不太规则,这时我们可以根据不加药细胞来画不规则的十字门。如上面图形的设门方式:
◆免疫染色与凋亡染色顺序问题?Annexin V凋亡染色可以和抗体一起对细胞进行染色吗?可以,但建议Annexin V和其它抗体分开染色。例如Annexin V、PI和CD3、CD8同时标记淋巴细胞,可以先在PBS中标记CD3/CD8后洗去,再在Binding buffer(含钙离子)中标记Annexin V。◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗?不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸,包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA,由于RNA的干扰,用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时,凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。 若果需要进行细胞周期检测,推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit(C6031)◆固定、冷冻、切片或解离的组织,还可以做流式细胞分析吗?不建议做流式细胞分析。因为流式细胞分析要求细胞分散、单个,活性好,这些状态下的样本外膜上的PS及膜的完整性都受到了影响,因此无法依赖膜的完整性区分健康细胞和凋亡细胞。组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡,同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片,不宜上流式检测,所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本,即取材后立即检测,效果最好。 液氮保存的◆组织块,可以将组织标本进行切片,然后做原位染色,观察组织细胞的凋亡。◆Annexin V可以用在植物和细菌中吗?Annexin V也可以用在植物和细菌中检测凋亡,具体实验步骤可参考相关文献。ebiomall.com
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各位,最近几个月一直在帮着公司进口细胞株,我是新手,从来没有接触过这样的业务,摸着石头过河,遇到了很多问题,也得到了很多教训和经验,不敢独享,觉得还是分享一下吧,给有需要的指指道,希望能少走弯路。
先不多说,正文如下:
大家看好了,我写的是企业进口细胞株,不是针对高校或者别的什么科研机构,因为到目前为止国家还没有一个正式的文件去指导企业进口细胞株,只有一个过渡性文件,因此各地操作时也有些不同,除了北京、上海、广东等一些发达的地方有操作程序,其他地方由于企业进口细胞株的案例很少,因此很麻烦的(比如黑龙江,我们最后都找到省卫生厅厅长了)。
首先,你们公司如果选择购买一个国外的细胞株,最先考虑的是付款问题,你得找一家进出口代理公司,帮你操作,这个都是比较常规的,另外你最好再找一家在北京或者上海的公司帮助清关。这里有涉及到“进口代理协议”和“供货合同,我们当时是签了一个三方合同”,这里一定要注意和国外沟通好,需要进口的细胞株的名称、数量、价值等等,后期发货的时候千万不要不一致。
因为细胞株是特殊物品,需要从省卫生厅那里拿到一个“医用特殊物品准出入境证明”,这个东西很难搞的(高校或科研机构容易一些,基本上都有程序),尤其是一些没有先例的省份(领导不敢批,怕担事),我们公司就是黑龙江的先例,这个东西不知道怎么办的到时候可以找我私聊。搞这个东西的正常周期是2-3周,请注意,一定要把准出入境的有效时间尽量写长一点,还有就是主送单位一定要你所清关的口岸的检疫局,例如北京口岸入境,就写北京出入境检验检疫局。当时没人提醒我,这两个我都搞错过,结果多跑了几次,我们的国家服务人员态度一次比一次差,快气死了,不过后来还是搞到了。
拿到“医用特殊物品准出入境证明”以后,预付款也打了,国外准备要发货了,这之前还要一个“特殊物品入境审批单”,这个需要到你所清关的口岸的检疫局搞,下面以北京出入境检验检疫局为例,这个东西要是你是外地的(非清关所在口岸)是搞不到的,你得先去北京出入境检验检疫局备案(就是公司证照原件,情况说明,单位说明等等,比较好办),然后在你细胞株进口之前2-3周申请(1周能批,有效期3个月)。我当时是委托北京一家公司办的,因为你自己办是不方便的,到时候审批单还要亲自去取,外地的很麻烦。
箱单、发票就不说了
接下来是运输,细胞株一般都用干冰运输,当然也可以选择液氮,不过价钱不一样,液氮要比干冰贵40%左右。要计算好运输过程中干冰损失量,量要足够,最好放一个温度记录仪,如果你没有把握,在货物到港清关之前,也可以加干冰的,就比较贵,单次1000元左右。发货之前一定和发货方、运输公司沟通好,标签和数量一定要准入证明和审批单一致,要不然清关很麻烦的,我再次犯了一个错误。
最后就是清关了,这里一定要注意,你找的清关公司的清关能力一定强,一定是做过冷链清关的。
总结一下:
程序是:签合同,找进口代理和清关公司,办理相关证明文件,选择冷了运输公司,运输,清关。
文件:合同、代理协议、医用特殊物品准出入境证明、特殊物品入境审批单、发票、箱单等。
另外,这里面还有不少细节,我就不一一说了,如果真有这方面运输的,可以找我。
版主horizon801留言:
谢谢分享
1.培养基最好是培养原代细胞专门的培养基或说是配套的培养基; 2.关键还是生长因子等的浓度; 3.如果需要的话,需要明胶包被.
1、 缓冲溶液对反应物的测定没有干扰
2、缓冲组分的浓度为1:1
3、有足够的缓冲容量
4、缓冲溶液的PH应在所需范围内
5、组成缓冲溶液的弱碱PKB和弱酸PKA应接近或等于所需的POH值或PH值(PH+POH=14)
配制
只要知道缓冲对的PH值,和要配制的缓冲液的pH值(及要求的缓冲液总浓度),就能按公式计算[盐]和[酸]的量。这个算法涉及对数换算,较麻烦,前人为减少后人的计算麻烦,已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系并列出了表格。只要我们知道要配制的缓冲液的pH,经查表便可计算出所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。
经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升,而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升,而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。
计算好后,按计算结果准确称好固态化学成分,放于烧杯中,加少量蒸馏水溶解,转移入50ml容量瓶,加蒸馏水至刻度,摇匀,就能得到所需的缓冲液。
各种缓冲溶液的配制,均按表格按比例混合,某些试剂,必须标定配成准确浓度才能进行,如醋酸、氢氧化钠等。另外,所有缓冲溶剂的配制计量都能从以上的算式准确获得。

