产品内容
储存条件本产品应置于-20℃储存，组分B需避光，避免反复冻融。有效期见外包装。注：组分A和B使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤，请立即用大量水冲洗。产品介绍细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体DNA的降解，这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段为180 bp-200 bp的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状Ladder图谱。本试剂盒采用TUNEL法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡细胞中断裂DNA的3´-OH末端催化掺入YF®/Cy-dUTP，YF®/Cy-dUTP标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL法可以选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的DNA链断裂的细胞。标记的dUTP（如地高辛-dUTP、生物素-dUTP），可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。注意事项1. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
UE-T6067S/T6067L1. 有些细胞或组织，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高，使得DNA全部被切断，易导致假阳性。建议：取出细胞或组织后要立即固定并充分固定，以阻止这些酶的活性，同时设置阴性对照。2. 内源性过氧化物酶影响，建议：对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度。3. 固定液浓度过高或过低，导致组织中心部分固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议：推荐使用4%多聚甲醛。4. TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。5. 石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合，所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底。6. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。◆为什么没有染上荧光？1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率.2. 细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，时间太长容易脱片，适当调整。3. 延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量。4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。◆如何对细胞核进行复染？可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。◆为什么荧光背景高？1. 支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证。2. TdT 酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用。3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；4. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。5. DAB 孵育时间过长，减少DAB 染色时间。6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合，在TdT 酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。◆标记率低？1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液。2. 固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间。3. 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：在凋亡诱导结束后，可以对多孔板进行1000g离心5min，然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。◆在蛋白酶K中消化组织样品多久？大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。◆实验的组织切片应该多厚？老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠厚度5–20 µm。
参考文献1.Apoptosis caused by Hsp90 inhibitor geldanamycin in Leishmania donovani during promastigote-to-amastigote transformation stage应用方向：细胞凋亡染色&流式分析
2.Notch gain of function in mouse periocular mesenchyme downregulates FoxL2 and impairs eyelid levator muscle formation, leading to congenital blepharophimosis应用方向：切片染色
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各位，最近几个月一直在帮着公司进口细胞株，我是新手，从来没有接触过这样的业务，摸着石头过河，遇到了很多问题，也得到了很多教训和经验，不敢独享，觉得还是分享一下吧，给有需要的指指道，希望能少走弯路。
先不多说，正文如下：
大家看好了，我写的是企业进口细胞株，不是针对高校或者别的什么科研机构，因为到目前为止国家还没有一个正式的文件去指导企业进口细胞株，只有一个过渡性文件，因此各地操作时也有些不同，除了北京、上海、广东等一些发达的地方有操作程序，其他地方由于企业进口细胞株的案例很少，因此很麻烦的（比如黑龙江，我们最后都找到省卫生厅厅长了）。
首先，你们公司如果选择购买一个国外的细胞株，最先考虑的是付款问题，你得找一家进出口代理公司，帮你操作，这个都是比较常规的，另外你最好再找一家在北京或者上海的公司帮助清关。这里有涉及到“进口代理协议”和“供货合同，我们当时是签了一个三方合同”，这里一定要注意和国外沟通好，需要进口的细胞株的名称、数量、价值等等，后期发货的时候千万不要不一致。
因为细胞株是特殊物品，需要从省卫生厅那里拿到一个“医用特殊物品准出入境证明”，这个东西很难搞的（高校或科研机构容易一些，基本上都有程序），尤其是一些没有先例的省份（领导不敢批，怕担事），我们公司就是黑龙江的先例，这个东西不知道怎么办的到时候可以找我私聊。搞这个东西的正常周期是2-3周，请注意，一定要把准出入境的有效时间尽量写长一点，还有就是主送单位一定要你所清关的口岸的检疫局，例如北京口岸入境，就写北京出入境检验检疫局。当时没人提醒我，这两个我都搞错过，结果多跑了几次，我们的国家服务人员态度一次比一次差，快气死了，不过后来还是搞到了。
拿到“医用特殊物品准出入境证明”以后，预付款也打了，国外准备要发货了，这之前还要一个“特殊物品入境审批单”，这个需要到你所清关的口岸的检疫局搞，下面以北京出入境检验检疫局为例，这个东西要是你是外地的（非清关所在口岸）是搞不到的，你得先去北京出入境检验检疫局备案（就是公司证照原件，情况说明，单位说明等等，比较好办），然后在你细胞株进口之前2-3周申请（1周能批，有效期3个月）。我当时是委托北京一家公司办的，因为你自己办是不方便的，到时候审批单还要亲自去取，外地的很麻烦。
箱单、发票就不说了
接下来是运输，细胞株一般都用干冰运输，当然也可以选择液氮，不过价钱不一样，液氮要比干冰贵40%左右。要计算好运输过程中干冰损失量，量要足够，最好放一个温度记录仪，如果你没有把握，在货物到港清关之前，也可以加干冰的，就比较贵，单次1000元左右。发货之前一定和发货方、运输公司沟通好，标签和数量一定要准入证明和审批单一致，要不然清关很麻烦的，我再次犯了一个错误。
最后就是清关了，这里一定要注意，你找的清关公司的清关能力一定强，一定是做过冷链清关的。
总结一下：
程序是：签合同，找进口代理和清关公司，办理相关证明文件，选择冷了运输公司，运输，清关。
文件：合同、代理协议、医用特殊物品准出入境证明、特殊物品入境审批单、发票、箱单等。
另外，这里面还有不少细节，我就不一一说了，如果真有这方面运输的，可以找我。
版主horizon801留言:
谢谢分享
1.培养基最好是培养原代细胞专门的培养基或说是配套的培养基; 2.关键还是生长因子等的浓度; 3.如果需要的话,需要明胶包被.
1、 缓冲溶液对反应物的测定没有干扰
2、缓冲组分的浓度为1:1
3、有足够的缓冲容量
4、缓冲溶液的PH应在所需范围内
5、组成缓冲溶液的弱碱PKB和弱酸PKA应接近或等于所需的POH值或PH值（PH+POH=14）
配制
只要知道缓冲对的PH值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度），就能按公式计算[盐]和[酸]的量。这个算法涉及对数换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系并列出了表格。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算出所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。
经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升，而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。
计算好后，按计算结果准确称好固态化学成分，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，就能得到所需的缓冲液。
各种缓冲溶液的配制，均按表格按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确浓度才能进行，如醋酸、氢氧化钠等。另外，所有缓冲溶剂的配制计量都能从以上的算式准确获得。
