PCR产物琼脂糖电泳求助
2021-07-30
问题描述：
大家好，本人是实验新手一枚，目前在学做琼脂糖电泳，我是提取基因组DNA，然后以500ngDNA为模板，按照以下反应体系PCR:Q5高保真热启动2Xmastermix12.5UL;上下游引物终浓度0.5uM,DNA模板500ng，加水补支总体积25ul,反应程序，98℃30s，98℃5S,62℃10s,72℃20s，35或者40个循环，72℃2min,4℃保存，PCR产物取5UL行2%琼脂糖电泳，EB染色，50ul琼脂糖胶加入10mg/mlEB染液5ul，但是结果几乎看不到条带，但是Marker很清晰。最后我把PCR产物用分光光度计测量浓度，发现浓度在400-600ng/ul之间，260/280接近1.80,我想知道我哪里做错了，才导致看不到条带呢？请园子里的老师指教，在此，我首先感谢大家了！
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mpark
用户
What kind of genomic DNA is? Do you have any gel picture showing genomic DNA? What the gene is to be amplified. I am not sure if 98 C, 30 S is good for Taq DNA polymerase activity.
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米扬my
用户展开引用mparkWhatkindofgenomicDNAis?DoyouhaveanygelpictureshowinggenomicDNA?Whatthegeneistobeamplified.Iamnotsureif98C,30SisgoodforTaqDNApolymeraseactivity.......老师您好，我用的是培养的细胞系，经慢病毒感染后提取的DNA，用的是TARAKA的全基因组DNA提取试剂盒。扩增的基因是CXCR4因，PCR用的酶是NEB公司的Q5HotStartHigh-Fidelity2XMasterMiX,扩增程序是NEB试剂盒推荐的，98℃30s也是试剂盒所给出的时间。
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米扬my
用户展开引用mparkWhatkindofgenomicDNAis?DoyouhaveanygelpictureshowinggenomicDNA?Whatthegeneistobeamplified.Iamnotsureif98C,30SisgoodforTaqDNApolymeraseactivity.......这个有条带的是第一次的实验结果，只是第一次之后就再也没有条带出来了！
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mpark
用户IcouldnotseeanygenomicDNA.FromhowmanycellsisgenomicDNAisolated?
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不说晚安的坏人
用户我最近做反转录也是产物跑电泳什么也没有，你要是找到了原因告诉我一下，多谢
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米扬my
用户mparkIcouldnotseeanygenomicDNA.FromhowmanycellsisgenomicDNAisolated?大于1x10的6次方，而且我提出来的DNA测浓度的话也都在100ng/ul以上呀
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米扬my
用户不说晚安的坏人我最近做反转录也是产物跑电泳什么也没有，你要是找到了原因告诉我一下，多谢你还是跟我一起找原因吧，坐等我的答案不现实。
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新来的新来的
用户你用的是什么琼脂糖
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不说晚安的坏人
用户米扬my你还是跟我一起找原因吧，坐等我的答案不现实。主要是我已经找了很久了没找到
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mpark
用户TrytomakefreshgenomicDNAandrun2-3ugofthesampleonthegeltoverifygenomicDNAbeforerunninganyPCRreaction.
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米扬my
用户mparkTrytomakefreshgenomicDNAandrun2-3ugofthesampleonthegeltoverifygenomicDNAbeforerunninganyPCRreaction.老师，您的建议我稍后会试试看。今天我用了PCR产物中的15ul（总共25ul）来跑电泳，终于看见条带了，但是这样算起来的话上样总量就有6ug了。因为我的目的片段只有500多碱基对，跟这个有关系吗？
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米扬my
用户新来的新来的你用的是什么琼脂糖这个琼脂糖
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米扬my
用户不说晚安的坏人主要是我已经找了很久了没找到那你的问题还没有解决？
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不说晚安的坏人
用户米扬my那你的问题还没有解决？没有啊
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米扬my
用户展开引用米扬my大家好，本人是实验新手一枚，目前在学做琼脂糖电泳，我是提取基因组DNA，然后以500ngDNA为模板，按照以下反应体系PCR:Q5高保真热启动2Xmastermix12.5UL;上下游引物终浓度0.5uM,DNA模板500ng，加水补支总体积25ul,反应程序，98℃30s，98℃5S,62℃10s,72℃20s，35或者40个循环，72℃2min,4℃保存，PCR产物取5UL行2%琼脂糖电泳，EB染色，50ul琼脂糖胶加入10mg/mlEB染液5ul，但是结果几乎看不到条带，但是Marker很清晰。最后我把PCR产物用分光光度计测量浓度，发现浓度在400-600ng/ul之间，260/280接近1.80,我想知道我哪里做错了，才导致看不到条带呢？请园子里的老师指教，在此，我首先感谢大家了！......谢谢大家的讨论的指导，最后我找了我们隔壁实验室的同学做技术指导，换了一种酶，然后跑出来了！接下来我准备采用他这次的体系和扩增酶来进行接下来的实验，希望自己实验顺利。后续实验情况会陆续更新，当然也欢迎大家指导和讨论！
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