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琼脂糖是线性的多聚物,基本结构是1,3连结的β-D-半乳呋喃糖和1,4连结的3,6-脱水α-L-半乳呋喃糖。琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似,但带硫酸根和羧基组分,凝胶能力差。
琼脂糖(Agarose)的特性详细介绍可以登录生物帮看看, http://www.bio1000.com/news/cp/ 生物产品,生物学新技术,生物研发,生物产业,生命科学创新产品。
TBE作为电泳缓冲液,其中的离子可以导电。并且TE作为DNA的储存液,可以保证DNA免受DNA酶的降解,其中的离子也可以稳定DNA的存在。
影响核酸电泳迁移率的几个因素
1、核酸分子大小
在一定浓度的琼脂糖凝胶中,DNA片段迁移距离和其含有的碱基对数量成反比,因此可以通过与标准条带迁移距离进行比较,由此得出目的条带的大小,但这仅对双链线性的DNA比较准确(DNAMarker一般为双链线状DNA),且对大于20kb的DNA不适用(普通琼脂糖凝胶很难将其分开)。
2、核酸分子构象
DNA分子在电场中的迁移速度不仅和分子量有关,还和它本身的构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中的移动速度不一样,移动速度次序为:共价闭环DNA>线性DNA>开环DNA。当琼脂糖浓度太大时,环状的DNA一般不能进入胶内(停留在孔中)。
3、琼脂糖浓度
同样的线状DNA分子在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同,DNA电泳迁移率的对数和琼脂糖凝胶浓度呈线性关系,凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围
凝胶浓度(%)线性DNA长度(bp)
0.51000~30000
0.7800~12000
1.0500~10000
1.2400~7000
1.5200~3000
2.050~2000
4、电源电压
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率和所加电压成正比。但电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分离率达到最大,所使用的电压不得超过5V/cm。
5、电泳方式
用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。垂直型电泳,一般用聚丙烯酰胺凝胶做为支撑物。水平型电泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。目前更多用的是后者,因为它制胶和加样比较方便,电泳槽简单,易于制作,又可以根据需要制备不同规格的凝胶板,节约凝胶,因而较受欢迎。
6、嵌入染料的存在
常用的荧光染料EB可以嵌入到堆积的碱基对之间,使其刚性更强,并使其迁移速率有所下降。
7、电泳缓冲液的离子强度
电泳缓冲液的组成和离子强度也能影响DNA的迁移速度。在离子存在很少的情况下(如无用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动;在高离子强度的缓冲液中(如误用10×电泳缓冲液),则电导率很高并产热明显,严重时能引起凝胶融化或DNA变性。
手提的斑马鱼RNA再反转录得到CDNA作为模板进行primestar,p的是斑马鱼的全长,但是全长p出来总是带有拖带的情况,有一个情况较好的图是这样的(mark左边的那一条)
我就用这个pcr的产物作为模板又做了一次,结果如下
求大神赐教!!!
请问各位大神,配制琼脂糖胶的电泳浓度是怎么设定,比如百分之1或百分之1.5的浓度是怎么设置,是1.5g的琼脂糖粉加100g的TAE麽?
最近在做小鼠基因型鉴定,之前做出来的效果很好,没有杂带,只有明显的目的条带,但是最近几次老是出现很多杂带,但是还是看得清目的条带,不影响判断。想请问一下有经验的朋友,这可能是什么原因引起的呢?该怎么避免?谢谢!
注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA,造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 电泳洗脱法
低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法
冻融回收法
玻璃奶回收法
柱回收法 将电泳槽用ddH2O反复清洗干净,倒入新鲜配制的灭菌电泳缓冲液;
根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板;
切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶;
要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤;
熔胶要完全。向左转|向右转