摘要：免疫初乳粉未（IP），控制性初乳粉末（CP）,脱脂乳（SP）对乳酸杆菌LGG在MRS培养基中发酵的影响，已经得到研究，同时也研究了IP对乳酸杆菌LGG在灭菌牛奶中发酵的影响。
在MRS中，SP能够在整个发酵过程中提高乳酸杆菌LGG的生长速度，尤其在5%与10%的CP初始浓度中，初期具有很好的只有在1%和2。5%浓度才有的反应速度。所有的CP(1%,2.5%, 5%, 10%)都能在发酵未期达到一个可生长的高的细胞浓度,这些表明在CP中含有LGG的生长因子及非特异性抗体的抑制作用被克服了.1%，2.5% 5%和10%的IP能够在整个发酵过程中抑制LGG的生长,临界的浓度点在2.5%与5%之间,并存在生长因子及特异抗体的抑制作用之间的竞争.
在灭菌牛奶中Hepes的影响能帮助发酵的快速进行,并比对照组更早地达到对数期,然而当混合有5%的IP时LGG的生长则在整个发酵过程中都要受到强烈的抑制.
在发酵及贮存过程中,LGG的发酵对抗龋齿抗体的效价变化没有明显的影响.在将来，它能应用于推动功能性发酵免疫乳产品的发展。
关键词 抗体乳酸杆菌LGG 发酵
1.介绍
在人类营养物中,probiotics是一个活的微生物食物组分,它有利于人体健康(salminener al 1998b)它能通过影响免疫系统抑制有害菌的生长,改善营养吸收等方式来改善人体健康.
大量的出版物已论述probiotics在胃肠道疾病的防止与治疗中起到非常重要的作用(salminenetal1998b,Gorbach sl1990)。乳酸杆菌属及bofodobacteria是通常用作probiotics的细菌属,从人体肠道中分离出来的LGG被证明是人体的一个重要的probiotics,(maija saxelin1995)，S.Elo和他的同事提出,LGG能够粘到人体肠道细胞(linecaco-zinvitro). 在PH3.0的胃液中也能很好地生存,通过降低葡萄糖苷酸酶的活性来很好地调节菌落的微生态.Alander M也提出LGG也能粘到菌落上,Ryseker-vanEmbdemIG(1998)证明LGG不会破坏肠道粘液中的糖蛋白,因此能够很安全地用于治疗,MajamaaH (1995)则认为某些乳酸菌株,特别是乳酸杆菌LGG,能够促进血清和肠道对轮状病毒的免疫反应,因此它也许在对待轮状病毒的再次感染的免疫建立非常重要.M malin(1997)证明LGG具有加强对青少年慢性关节炎的粘膜屏障机制的潜能,
在奶牛初乳中的免疫球蛋白的浓度是牛奶的50~100倍,可以从用特异性微生物抗原进行全身性高度免疫的奶牛中获得特异性初始抗体。(Hannu korhonen et all,1998)。越来越多的临床研究证明免疫乳的制备对人体胃肠病的预防及治疗的功效,Roos et al(1995)证明从牛初乳中得到的免疫球蛋白在人体胃肠中至少能部分地保持其活性.
虽然,在牛初乳抗体和Probiotics功能研究方面都各自取得很大的成功,但在抗体及乳酸菌(尤其是LGG)的共同存在方面的研究还是很少,有许多问题需要回答,例如,在(vitro及vivo)胃肠道病的预防与治疗方面,抗体及pribiotics的协同功能.例如,粘附到粘膜等上皮的过程和机制中的主要作用因子。这个研究的主要目的是调查抗体是怎样影响LGG的发酵的.以及在发酵及贮存中LLGG是怎样影响抗体的生物成分的.
2.材料与方法
2.1菌种： LGG菌种是由芬兰农业中心食物研究院提供,曾保存在-70℃的菌种，放在10%的消毒牛奶中激活12小时,然后移植到MRS固体培养基中,在通风条件下,37℃恒温10小时.培养液在3000g下离心10分钟,分离出细胞,弃去上清液,沉淀物用消毒约0.7%的生理盐水冲冼两次,活细胞的沉淀物留在生理盐水中以作为发酵初始物。
2.2培养基. MRS液体培养基是按照下列配方制成的.然后在115℃杀菌15分钟。
灭菌牛奶：鲜牛奶在15000rpm下离心15分仲,除去脂肪及酪蛋白,然后在85--杀菌1小时.
SP是由valio公司提供
抗龋齿的IP及CP是按照v。loimaranta及同事(1997)讲述的方法得到的,20%IP和20%CP溶入支离子水中,然后通过微量过滤进行灭菌.SP CP IP分别认1% 2.5% 5% 10%(W/V)的浓度加入到MRS中.
在牛奶消毒之前,加10nM的Hepes到消毒牛奶中,另外根据实验计划加入5%IP.
2.3 活细胞计数 活细胞是通过0.7%生理盐水稀释10倍而估计的.在MRS琼脂中加入样品10-5 10-6 10-7的稀释液100ul,每一个稀释度都做两个平行样.在37℃恒温48小时后,就可通过数菌落数来决定每一组活的细胞数.
2.4PH决定：pH计
2.5 乳酸决定：1ml样品用灭菌稀释到5ml,保持沸腾状态,加入Ltul的phendphtalin(0.5% in 95% ethanol)m然后在搅拌的情况下用0.1NnaoH进行滴定当试样变红并稳定30S最后乳酸变可用1ml0.1NnaoH相当于0.009乳酸的当量进行计算.
2.6酶联免疫吸附测定. 聚苯已烯微效价平板的小孔(labsystems Finlsnd)用100ul（10 CFU/ml）的被热杀死的S,matans磷酸缓冲液悬浮液覆盖.在4℃恒温过夜.小孔在Mutiwash系统中用含有0.05%吐温20的PBS冲洗三次,再用离子水冲洗三次.
IP样品在六种不同稀释度下(1:10001:3000 1:9000 1:27000 1:81000 1:24300)进行多次测试.每小孔中加入各种稀释度的100ul倍数体积，至抗原覆盖平板.在37℃恒温，然后按前面的方法冲洗小孔。加入150ul的碱性磷酸酶结合牛抗体LGG,在37℃作用90分钟,冲洗后，平板用150ul的溶解在二乙醇胺,Mgcl2缓冲液中的对硝基酚磷酸盐作用于30分钟.然后在405nm中进行快速吸收测定.
2.7乳酸菌LGG在MRS及鲜牛奶中的发酵
对数期的激活恬细胞收集起来,用0.85%的灭菌生理盐水冲洗三次,悬浮在生理盐水和vortex中使它处于非正常状态。使用100ul的倍数体积，可以使活细胞处于悬浮状态。加入200ul(A) 1ml(B) 2ml(C)的悬浮液于100mlMRS 培养基中培养。PH值,乳酸,活细胞由发酵时间决定.
在灭菌牛奶中两种不同的培养方法使用,在发酵期，监控PH值,乳酸,活细胞数目。.
2.8 在MRS中SP、IP、CP对乳酸菌生长的影响.
将1%，2.5% ，5% 和10%的IP ，CP加入用ＭＲＳ中作为测试组，而１％ 2.5% 5% 和10%的SP加入到MRS液体培养基中作用控制组.在100ul的各组培养基中接入0.1ml的LGG生理盐水悬浮液,在37℃下培养至达到对数生长期.在发酵过程中,从各组中取出4mll的aliquit认检验PH,乳酸及活细胞,这样进行多次取样.
2.9在牛奶中Hepes系统对LGG生长的影响
在高压灭菌之前向无菌牛奶中加入50mMHepes来形成Hepes群,这个消毒牛奶被标记为控制组接入活细胞悬浮液,在37℃下培养48小时,PH 乳酸,titres,活细胞随后进行,48小时后,这些群得存在4℃下,上面这些因素,每几天都要检测1次.
2.10 在Hepes牛奶缓冲液中IP对LGG生长的影响在上面提到的各组中加入5%IP,所有过程与上面的一样。
2.11LGG的贮存试验 :同上面提到的。
3. 结果
3.1在MRS及鲜奶中LGG的发酵:
在MRS中接入三种不同量的活细胞,向灭菌鲜牛奶中导入两种不同的接种量.活细胞，乳酸，PH值的指数要不时地检测，以决定发酵对数期,很明显,在MRS培养基及FM中,LGG的生长有明显的不同。在MRS中LGG的对数生长期大约9小时,不管开始活细胞的接种量.在整个发酵过程中,PH值的变化,乳酸代谢,活细胞都没有显著的不同.(图1)然而,不同的接种量会显著地影响PH值的变化,乳酸代谢及活细胞数。对数期的平台大约36~48小时(图2)
3.2 在MRS中SP、CP、IP对LGG生长的影响
1%,2.5% ,5%,10%的SP放入MRS培养基中,在37℃时接种,PH值及活细胞要在24小时内测定多次.结果表明,1% 2.5% 5% 10%的SP能够显著地提高LGG的生长,而对数期与控制组相比明显变化.但是在2.5%SP组中发酵了8~12小时发现异常.很有意思的是发酵了8~10小时,1%2.5% 5% SP的PH值缓慢上升,因为有些蛋白质被断裂,氨基暴露出来，中和了酸。在CP组中,1% 2.5% 5% 10%的CP同样能够提高LGG的生长,比起SP组来对数期则延缓了2小时,PH的下降缓慢，8~10小时平稳,在IP组中所有的测试浓度对LGG的生长起抑制作用。具有强抑制的关键点，在2.5%~5%之间.(Figure5)
3.3在牛奶中Hepes缓冲系统中对LGG生长的影响
向鲜牛奶中加入50umolHepes,接入LGG,这一点与控制组同时进行,在37℃下培养48小时,在6 12 24 36 与48小时的时间点上取样,检测其PH值,乳酸及活菌数.
很明显,在开始Hepes能提高LGG的生长,其对数期比控制组稍早一点.在前24小时内其乳酸量比控制组稍高,但24小时后,乳酸增加得很慢.鉴于控制组中能很快提高,与活菌计数结果相适应,因此认为在控制组的对数期比Hepes组晚.
3.4 在有Hepes缓冲系统的牛奶中IP对LGG生长的影响
5%的IP加入到含有50mMHepes的鲜牛奶中,测试结果显示在图6中,在0~6小时，IP强烈控制LGG的生长,无论是含有Hepes还是不含.在6~24小时内,两个IP组都进入对数期,看上去含有Hepes组要比无Hepes的IP组,更早地进入对数平台期,因为在某种浓度下,中性PH值能帮助抗体抑制生长.值得注意的是,无Hepes的IP组能在24小时后继续对数期,在48小时后,缓慢进入平台期,比起Hepes组及前面提到的控制组稍晚一些.
虽然在36~48小时之间,乳酸增加得很快,PH值则保持恒定甚至有点升高.这很有可能与牛奶中蛋白质的剪切作用有关,碱性基团被暴露，中和了乳酸,这一点与图3的结果非常相似.
看上去Hepes与IP对LGG生长的作用不同,Hepes能加速LGG的生长,因此对数期的出现比对照组的早,它可以通过减少乳酸的抑制而维持中性环境，以适应其生长,虽然离子浓度对发酵有一些影响。相反,IP能在发酵初期抑制LGG的生长,其对数期的出现比控制组的稍晚一些.但是,比Hepes组和控制组,它至少能达到相同量的活细胞量,且乳酸量更高.当IP与Hepes相混合时,情况就不一样了.在发酵的初期,LGG的生长同样受到强烈抑制.随着乳酸的生成,LGG的生长超过IP的抑制作用,但是当它达到一定浓度时,生长与抑制达到平衡.因此,Hepes加强了IP抗体的作用,而乳酸通过改变PH值，减少IP对LGG生长的抑制作用.
值得注意的是，IP的效价在6小时处达到最高,此时LGG同样受到强烈抑制.因此，在效价与LGG的生长之间存在一些明显的联系或机制。在6小时处,IP+LGG的效价比Hepes+IP+LGG， Hepes+IP的明显低,因此,Hepes在维持PH于中性时起着重要作用,这一点有利于免疫球蛋白达到最高活性,与IP组相比,在6小时处,IP+LGG组的效价明显更低，虽然PH并无明显不同,因此,在某种程度上,乳酸能够抑制免疫球蛋白的活性。(图7)
3.5 LGG的贮藏试验 当LGG的生长达到对数期的平台期时，在4℃保存,其活细胞量，PH，乳酸，效价要不时地检测。(看图8,9)
Hepes是影响LGG生存的主要因素,在无Hepes存在时，在4℃下，IP与控制组可以在50天内维持活细胞量基本不变.然而有Hepes组只能在前31天维持不变.然后急剧下降,
从图8,我们可以看到：无Hepes组的PH值维持不变或持续下降,然而在有Hepes组中，因为细胞的死亡及溶菌作用，PH慢慢上升.
至于效价，在Heper组与无Hepes组中并无明显不同,在50天贮存期内,LGG对免疫球蛋白效价的影响很小.
4．讨论
一般ptobiotics是以它对酸与胆汁的抵制为特征的.它粘到肠道上皮细胞上,并在肠道中复制,乳酸杆菌是人类健康上运用很广的probiotic菌.从人胃肠道上分离出来的LGG被认为是抗酸抗胆汁菌株。它能暂时在人胃肠道上生存,复制,生长出抗菌物质,影响存在的微生物的代谢活性,它同样可以在口服抗生素时，在肠道内复制。
在这个研究中，在MRS中，LGG有相同的发酵时间9小时,相同的PH值及乳酸曲线而不管MRS培养液中活细胞中的接种量。然而,LGG在灭菌牛奶中有一个很长的发酵时间,很少有以LGG作为起始物的报道.在牛奶中LGG生长的关键因素是接种量和对数期的状态.有利于身体健康的LGG和最小口服剂量是1010~1011CFU/天,可以服用冷冻干粉.发酵牛奶或a fermented whey drink .
在发酵的牛奶中，活细胞量通常是10--CFU /ml，因此100-200ml的发酵牛奶可以提供1010~1011CFU.我们试验同样显示了,虽然以单菌株作为起始物,LGG能够达到109CFU/ml.
为了观察IP及CP在MRS中对LGG生长的影响,把不同浓度的IP、CP加入到MRS培养基中，SP则被作为控制物。
所有的SP组在整个发酵过程中都能提高LGG的生长，尤其在5﹪与10﹪的浓度下。很明显，SP起缓冲作用及给细胞的快速复制提供特殊碳氢化合物及氮源。在8-10小时期间，SP的PH曲线比控制组稍高，可能是因为在一过程中蛋白质的剪切作用和某些肽键的暴露，来支持细菌生长及PH缓冲系统。
在0-4小时内，CP给细胞复制一个好的起始速度，这一点暗示CP可能含有LGG生长因子，因此克服了一般细菌生长模型的激活期。当进入对数期（6-8hr）时，CP组中的细胞生长要比控制组中的慢，说明一些非特异性抗体的抑制作用。在8-12小时，细胞通过抗体克服抑制作用，再次达到比控制组高的水平。很可能，
CP中的生长因子是通过抗体来克服抑制作用的。
至于IP组，好像IP中的抗体在发酵期起重要作用。它们在整个发酵期抑制LGG细胞的复制，尤其在发酵初期。1﹪与2.5﹪IP组和5﹪和20﹪IP组中有所不同,暗示了在2.5﹪和5﹪之间,是弱与强抑制作用的临界。IP的浓度越高,抑制越强,LGG的生长越慢:从PH变化曲线看，1﹪与2.5﹪IP组的PH值比起控制组来说下降得非常快,这一点也与CP组不同.
总的来说,SP,CP与IP由于其组分不同，对LGG生长的作用也不同.SP含有适合LGG生长的普通碳氢化合物及氮源,而CP含有能部分抑制细胞生长的非专一性抗体及LGG的生长因子.因此,在两种情况下LGG的生长有很大的提高.然而,IP的情况就完全不同,它里面存在一些对链球菌属突变体的专一性抗体,它能强列抑制LGG的生长,同样含有一些LGG的生长因子,这些原因导致了LGG的生长缓慢。抗体的抑制作用与IP中生长因子的竞争，同样受到IP中的微量胰蛋白酶及胰凝乳蛋白的影响.两种酶都能减少抗体的活性.然而,我们的结果显示抗体的效价在发酵过程中几乎没有变化。(数据并无显示).
用在无菌牛奶中的Hepes缓冲液，是用来检查LGG牛奶发酵中IP的功能。Hepes对LGG的生长有两个不同的功能.在一方面,Hepes能够减少积累的乳酸对LGG生长 的抑制作用.另一方面,它能够在某种程度上通过保持PH于中性，来帮助抗体维持在一个稳定的功能状态.我们的测试，显示HePes能够使发酵快速开始和比控制组更早地达到对数期.但是,当与IP结合时这个结果就会相反; IP 组则受到轻微的抑制.虽然对数期来得更晚,它同样能使活细胞数达到控制组那样多.这个结果与MRS中有IP的发酵结果相一致.
LGG的货架生命力与抗体的效价，是我们测试中的关键。贮存试验显示，在4℃下,所有的牛奶发酵组的活细胞都能在31天内维持在相同的水平.31天后,有Hepes组下降得更快,而无Hepes组则能继续保持在相同水平.看上去在贮存期间,IP对LGG的货架生命力只有微小的影响.PH变化有小的不同,然而无Hepes组的乳酸代谢比hepes组更活跃,这一点与活细胞贮存相一致.有Hepes组与无hepes组中的效价变化并无不同,发酵牛奶在4℃能在10天内使效价保持相同水平,在31天内保留50％,50天内仍大于30%。而且我们的实验显示：在4℃ ，发酵免疫牛奶中的抗龋齿抗体的功能在贮存50天后，仍能保持完整.
使用probiotics细菌进行免疫牛奶发酵是开发人类健康功能食品的新领域.为得到更多有关抗体对probiotics发酵的普通机制的信息,不同的菌株及不同的专一性抗体在将来都要被测试.功能实验也要在抑制期与活跃期中进一步进行.因为有一些probiotics菌的普通抗原能与抗体相作用,以及发酵过程中的凝集作用,我们应该选择一些probiotics菌，来避免此类凝集反应,或用probitics菌的非专一性抗体来组成免疫牛奶.虽然免疫牛奶的发酵是开发功能食品的可行性方法,怎样保持抗体活性及在发酵前怎样在同一时间对免疫牛奶进行了灭菌，仍然是个问题.将来一些特殊的技术过程仍要得到改进.
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请想象一下，上百只兔子，老鼠甚至是山羊等动物拥挤在狭小的笼子和窝棚中，吃着劣质的饲料，忍受着病痛的折磨，还要定期被注射针剂，抽取血清。履行完“使命”的动物们甚至要接受安乐死。这是一幅多么可怕的景象！而我们经常使用到的抗体，有很大一部分就是这样被制造出来的。
7月21日，数位科学家在Cell的子刊TrendsInBiotechnology发表文章，揭示了传统抗体生产方式给动物福利带来的严重危害，并呼吁各界使用噬菌体病毒技术来替代动物生产抗体，以保护动物福利。文章指出，尽管这种技术与传统的动物生产模式相比有众多的优点，但还是被人所忽视。人道主义行为，并不一定以牺牲生产力作为代价。改变人们的观念，与改进技术同等重要。
残酷的现实
抗体是一种最常用的生物试剂-不仅仅在基础科研领域，它们也被广泛应用在疾病诊断，临床治疗等各个方面。生物医学领域对抗体的种类和数量有很大的需求。举例来说，仅人类基因组就有20000-25000个编码蛋白质的基因，而mRNA剪切，翻译后修饰等生物过程又会产生许多蛋白质的变体，将蛋白质种类扩大10倍以上。如果要检测这些蛋白质，就必须用到相对应的抗体—强烈的需求创造出了这个发达的市场—全球共有超过200万种科研抗体产品，仅在欧美就有300余家科研抗体供应商（详见：2016年全球科研抗体行业报告）。据估计，整个抗体相关市场规模高达800亿美元以上【1】。
而传统的抗体生产方法极大地依赖于动物。用于抗体生产的动物们会接受免疫—被注射抗原和佐剂，激发体内抗体的产生—然后从腹水中分离目标抗体（多克隆抗体），或从肾脏中提取淋巴B细胞，与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而从中提取出目标抗体（单克隆抗体）。
在全球，有上百万只动物被用于抗体的生产和研发。据统计，英国在2013年共有9522只动物被用于抗体生产。而在荷兰，这个数字高达25697只【1】。尽管随着文明的进步，动物福利被越来越多的公司所重视，可还有一些利欲熏心的抗体供应商违背法律和道德，从动物身上榨取利润。在今年五月，抗体行业的巨头SantaCruzBiotechnology就被指控虐待动物，遭到了美国政府350万美元的天价罚款，并将被禁售多克隆抗体（详见：2016第一个或将倒下的抗体巨头）。为什么说SantaCruzBiotechnology是抗体巨头呢？因为仅这一家公司所使用的动物数量，在2013年就达到了15648只，超过了全英国总和的1.5倍！
在今天，依旧有许多宣称“动物友好（animal-friendly）”的传统抗体生产方式，但实际上一点都不“友好”！
技术的突破
为什么一定要利用动物来制造抗体呢？难道是技术的局限性吗？
在过去20年间，真正意义上”动物友好“的抗体生产方法在迅速发展，并且早已在技术上十分成熟，足以替代传统的抗体生产方式—利用动物免疫。已经有多种动物友好性亲和试剂（animalfriendlyaffinityreagenats,AFA)被成功开发出来，甚至投入商业化生产。这些试剂的生产完全独立于任何活体的免疫系统，并且能够替代现有的动物免疫技术手段，在广泛的范围内得到应用。AFA是由噬菌体展示，核糖体展示或者酵母菌展示在体外生产出来并进行筛选的。这些产物主要是抗体，但同时也涉及一些非抗体的亲和试剂，如DARPins，affibodies，monobodies，anticalins或其它产物。这篇文章主要强调了一种最成熟，适用性最高的方式—噬菌体展示。
文章指出，使用噬菌体展示制造的抗体，并不仅仅是”看起来像抗体“或者”与抗体有相似的作用“，它们实际就是”原装“的抗体—它们拥有与活体生产出来的抗体完全相同的生物活性—在开发上，功能上，以及结构上，它们无法与活体生产的抗体区分开来。并且，它们的特异性比活体制造的抗体还要优秀，能够有效避免抗体的多态性，继而减少抗体引发的可重复性问题。同时，它们的生产成本更低，产能更大。理论上来说，只需要构建一个良好的噬菌体展示Library，并进行合理的筛选措施，即可利用这种技术生产出与活体生产等效的抗体。即使生产出来的抗体质量不符合预期，也可以利用各种体外手段来改进抗体的特异性，亲和力以及其他特征。目前，一些大规模的比较性研究，如StructuralGenomicsConsortiumSH2Pilot、EUprogrammeAffinityProteome、NIHCommonFundProteinCaptureInitiatives，都证实了利用噬菌体展示生产的抗体，在不利用杂交瘤细胞（单克隆抗体制造技术）的情况下，能制造出完全等效的单克隆抗体。市场上以及有一些比较成熟的非动物来源的抗体了：如ABD和Yumab。
政策与法规
人道主义和动物保护，在西方国家中一直占有重要的地位。文章中例举了欧盟的科研用途的动物保护政策：3Rs原则—替代，减少，精炼（replacement,reduction,refinement)。从名称上，我们不难看出这项法规的目的就是为了利用政策的调控，促进动物替代品在科研中的应用，从而减少实验动物的使用。例如，法案规定”如果可能，一项技术上满足标准的方法或实验手段（不涉及动物使用），应该作为动物实验的替代方法。“另外，法案还规定“如果有其它可以得到理想结果的方法被欧盟法规认可（不涉及动物使用），那么某项涉及动物的实验步骤就不能被执行。”这些规定意味着，在每个欧盟成员国，包括抗体生产在内的各项动物实验都要经过政府部门的审核与评估，以确保”动物使用是唯一的合理选择“。
在欧洲，这就为替代动物生产抗体提供了法律上的支撑。虽然噬菌体展示方法可以作为动物的完美替代品，但由于人们对一些概念上的误解，导致审批部门认为动物生产抗体的方式是”无法替代的“。因此，许多抗体制造的项目依旧可以通过审批，这项替代技术也没有得到足够的重视。
光明的未来
文章的第一作者，来自诺丁汉大学的访问学者AlisonGray博士表示：“科学家们在这个领域的终极目标，因该是在研究和生产上完全替换动物。然而，由于人们对这些替代技术缺乏足够的意识，改变来的不会那么快。利用噬菌体展示来制造多抗和单抗的技术，早在二十年之前就存在了。这是一项高性价比的技术，足以替代当前如此巨大的实验动物用量。事实上，这项技术已经足够成熟，足以淘汰现有的动物免疫手段。”【2】
因此，基于欧盟的3Rs原则，AlisonGray博士带领众多科学家提出了7项行动计划，用来替代动物制造抗体—由欧盟领导，延伸到科研机构和生物技术产业：
1.完全替换利用动物免疫的方式来制造抗体，包括抗体相关产品的进口，除非能够被证明在某些情况下AFA无法作为替代品。
2.应当建立一个专家工作小组，专门策划使用AFA来替代动物抗体的行动路线。
3.设立项目，以促进这项新型技术的转化和扩散。这应该包括设立技术中心，为抗体生产者提供AFA技术培训，确保提供足够的技术支持。
4.应该对非欧盟地区的动物来源抗体生产进行评估，以保证这些抗体的生产是符合欧盟标准的，尤其是在一些动物保护法规较弱的地区。
5.欧盟参考实验室（EURL）应该与它的国际合作伙伴一起扩大活动领域，将AFA的生产和应用包含在内。
6.服从3Rs原则的欧盟国家和机构，以及按照欧盟法规进行化妆品，药品以及食品的商业机构，应该全力支持3Rs原则，停止动物来源的抗体相关产品的进口。
7.由欧盟委员会出具的实验动物统计数据报告，应当把”用于抗体生产的动物“单独归为一个类别。
总结
作为替代医学实验动物基金（FRAME）的主席，AndrewBennett博士对这篇文章做出了很好的总结：”Gray博士的这篇文章指出了一个在抗体制造领域十分反常的现状：一方面，抗体可以不依赖于动物来制造，并且这项技术十分成熟；但是另一方面，每年却有成千上万的动物在抗体制造的过程中被杀害。利用动物来制造抗体，是完全没有必要的。更重要的是，利用动物生产出来的抗体，会引发严重的质量问题—有很大一部分抗体效果很差，甚至是无效（详见这里）。相比传统的抗体生产方式，噬菌体展示技术有潜力制造出特异性更强，功能性更好的抗体。“【2】
参考文献
【1】GrayAC,SidhuSS,ChandrasekeraPC,etal.AnimalFriendlyAffinityReagents:ReplacingtheNeedlessintheHaystack[J].TrendsinBiotechnology,2016.
【2】http://phys.org/news/2016-07-scientists-animals-antibody-production.html
