| 实验步骤 |
一般情况下，单克隆抗体（尤其是大鼠源性）不能用蛋白A或蛋白G交联琼脂糖凝胶层析纯化，在此情况下，可使用抗大鼠Ig轻链单克隆抗体交联琼脂糖凝胶层析柱来结合组织培养上清或腹水中的大鼠单克隆抗体，然后用逐步降低洗脱液pH的方法来确定从抗Ig柱上洗脱大鼠抗体的最温和洗脱条件。 附加材料（其他材料见基本方案2)小鼠抗大鼠/c链MAb:用蛋白A交联琼脂糖凝胶纯化的MAR18.5(ATCC)(见基本方案2) 溴化氰活化的琼脂糖凝胶CL-4B(单元12.2;PharmaciaBiotech) 结合缓冲液：0.05mol/LTris•HCl(附录I)/0.15mol/L 待纯化的大鼠抗体粗提液（MAb上清或腹水，单元I.4) PH7.0洗脱缓冲液：0.05mol/L磷酸钠（附录I)/0.15mol/LNaCl/0.02%(m/V),NaN3，pH7.0 pH5.5洗脱缓冲液：0.05mol/L柠檬酸钠/0.15mol/LNaCl/0.02%(m/v)NaN3，pH5.5 pH4.3洗脱缓冲液：0•05mol/L乙酸钠/0•15mol/LNaCl/0.02%(m/V)NaN3，pH4.3 pH2.3洗脱缓冲液：0•05mol/L甘氨酸/0•15mol/LNaCl/0.02%(m/V)NaN3，pH2.3 1.将≥10mg纯化后的MAR18.5抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B共价偶联，Iml湿凝胶约可以偶联IOmg左右的MAR18.5抗体，此柱可结合Img左右蛋白质（单元12.2)，将偶联的凝胶在4°C或室温下用结合缓冲液冲洗。 2.提纯腹水或MAb上清（见备选方案1，步骤Ia或lb)，将含大鼠抗体粗提液的IOml左右腹水或IOOml左右MAb上清上样。 3.用10〜15倍柱体积的结合缓冲液洗柱，监测A280值，使其回到基线水平，放置组分收集器准备收集洗脱液。 4.分别用以下洗脱液各洗脱5个柱体积，在用下一个洗脱液之前要确定A280已回到基线。 pH7.0洗脱缓冲液 pH5.5洗脱缓冲液（某些抗体会洗脱） PH4.3洗脱缓冲液（多数抗体会洗脱） PH2.3洗脱缓冲液（所有抗体会洗脱，洗到A280回到基线） 5.用≥10个柱体积的结合缓冲液平衡层析柱，置于4°C保存。 6。鉴定洗脱的蛋白质峰（包括未结合的洗脱组分），合并各洗脱液，检测抗体活性，如有必要，可将其浓缩（见基本方案1，步骤6)。 |
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