| 实验方法原理 | 与酶桥法相似，不同的是酶桥法分四步，而PAP法分三步。PAP法将酶桥法的步骤（3）、步骤（4）合二并为一，用PAP复合物替代，故称PAP法（图4-9）。PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体必须为同一种属动物的IgG，这样桥抗体才能作为「桥」将PAP复合物连接在第一抗体上，如特异性一抗为鼠来源的，那么PAP复合物必须用鼠的。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 石蜡切片动物血清 试剂、试剂盒 | 蛋白酶特异性一抗桥抗体PAP复合物PBSDABH2O2树胶二甲苯乙醇 仪器、耗材 | 滴管玻片 实验步骤 | 1.4μm石蜡切片58℃烤片4h，切片常规脱蜡至水。 2.蛋白酶消化或AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。 3.0.3％H2O2处理切片20min（室温），PBS洗3min×2次。 4.3％正常动物血清处理切片30min（室温），吸去多余血清，不洗。 5.适当稀释的特异性一抗孵育（4℃过夜或37℃60min），PBS洗3min×3次。 6.滴加桥抗体（二抗），37℃孵育40min，PBS洗3min×3次。 7.适当稀释的PAP复合物（要求与特异性一抗同一种属）37℃孵育40min。 8.PBS洗3min×3次。 9.0.04％DAB-0.03％H2O2显色8～12min。 10.水洗、复染、脱水、树胶封片，结果观察。 注意事项 | 1.假阴性及其处理 应用PAP法显示抗原含量较多的组织或冰冻切片抗原保存良好的标本时，可导致阴性结果。Bigbee（1977）的研究证实，阴性结果是由于第一抗体用董过高，与组织抗原结合过多，使相邻两个抗体的Fc段间的距离恰好是连接抗体的两个Fab段结合的长度，于是连接抗体不存在游离Fab段，仅存无活性的Fc段，所以不能将PAP复合物连接在与组织抗原结合的第一抗体上，导致阴性结果。尤其是冰冻切，而石蜡切片很少发生这种现象。克服的办法是将第一抗体尽量稀释。 2.桥抗体 也称连接抗体。它的两个Fab段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力，因此，当第一抗体和PAP复合中抗HRP抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述二种抗体结合，起到桥的作用。为丁确保桥抗体的二个Fab段之一与第一抗体结合，另一个与抗HRP抗体结合，桥抗体的浓度必须高于常规用的第二抗体。 3.PAP复合物 在PAP法和酶桥法中，特别强调第一抗体和抗HRP必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连接在一起。 其他 | |
