抗体产生细胞的检测:溶血空斑实验
实验材料 | 健康小鼠 试剂、试剂盒 | 绵羊红细胞悬液Hanks液凡士林油 仪器、耗材 | 注射器平皿漏斗纱布研钵 实验步骤 | 1. 免疫动物 取25%绵羊红细胞悬液1毫升,无菌操作注入小鼠腹腔中。 2. 脾细胞液的制备 (1)小鼠免疫4天后,颈椎脱位处死,取脾脏,去除脂肪组织,放平皿内,用冷Hanks液洗1~2次。 (2)取出脾脏研钵中研碎,加Hanks液2~3毫升,用吸管反复吹打数次,使细胞分散。将此细胞悬液经4~8层纱布过滤,1500转/分离心5分钟,弃上清。 如细胞太多,可加蒸馏水4毫升迅速混匀,半分钟后立即加入等量Hanks液混匀1000转/分离心10分钟,弃上清。 (3)沉淀细胞用Hanks液洗1~2次,弃上清后,加Hanks液使总量达5毫升。用乳头吸管吹打使沉淀细胞悬起混匀,此即为50倍稀释的脾细胞。 (4)取此悬液0.1毫升放另一小试管中然后加0.9毫升Hanks液使成500倍稀释的脾细胞悬液。 3. 玻片小室的制作 取洁净(无油)的载玻片,按下图粘三条透明胶带,在胶带上薄涂一层凡士林(勿涂到小室内),然后用镊子取两个盖片,分别放在其上,制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢(保持小室一定体积)。用凡士林将盖片底端(其中的任一端)封住,顶端作为注入细胞混合液。 图1 玻片小室示意图 4. 细胞混合液的配制 取小试管一只,用1毫升吸管吸取0.2毫升指示细胞悬液,用另一吸管吸取0.2毫升500倍稀释的脾细胞悬液,混匀即为被检的细胞混合悬液。 5. 混合细胞的灌注 用100ul的微量加样器吸取被检细胞混合悬液,于小室开口一端轻轻将液体注满小室(勿使气泡产生,勿使液体外溢),记录实际注入的细胞悬液微升数(约70ul) 每个样品注2个小室,取其平均值。 6. 用牙签粘取少许凡士林益封小室开口。 7. 将作好的标本水平置湿盒中,放37℃温箱中孵60分钟 8. 溶血空斑计数 肉眼观察空斑并计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑可在低倍镜下检查,真正的溶血空斑必须中心有一个淋巴细胞,周围为透明区。 全脾脏中抗体产生细胞总数可依下述公式计算: 注意事项 | 脾细胞悬液制备过程中应在冰水浴中进行。 |
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发布于 : 2021-08-23
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