AGScientific,Inc.成立于1997年,专注于创新生化制剂以及用于诊断测试开发的定制原材料,以推进临床前研究药物开发。产品涉及抗生素,生物洗涤剂,缓冲液,诊断,酶,医疗设备试剂,蛋白酶K,还原剂,RNaseA等。
CHAPS是一种两性离子洗涤剂,广泛应用于蛋白质纯化过程。作为这类洗涤剂的一部分,CHAPS含有一个正电荷和一个负电荷,但没有一个净的总电荷。CHAPS的生物膜亲和力相对较低,但在特定的浓度范围内可以有效地诱导溶血和蛋白溶解。CHAPS被归类为一种临界胶束浓度为6-10mM的非变性表面活性剂。
CHAPS的应用:在实验室中,CHAPS和其他两性离子洗涤剂可用于在分离蛋白之前诱导细胞裂解。它也可以用作二维凝胶电泳过程中的缓冲液,在某些情况下,它比SDS等阴离子洗涤剂更受欢迎。在蛋白质分析之前,可以通过透析从溶液中去除CHAPS。另一种技术利用专门的树脂和旋转柱也可以用来有效地去除皲裂用于监测化学反应或蛋白质结合的紫外/可见光谱学•用于离子交换色谱和等电色谱•用于细胞的膜渗透•以酶特性作为变性缓冲液的成分
嘌呤霉素盐酸盐是从阿氏链霉菌中分离得到的氨基糖苷类抗生素。嘌呤霉素是一种蛋白质合成抑制剂,它将自己整合到一个正在生长的多肽链中,导致其提前终止。嘌呤霉素的主要应用是作为基因选择抗生素,在CRISPR/Cas9基因编辑中发挥重要作用。这种以盐酸盐形式存在的嘌呤霉素试剂具有抗肿瘤、抗锥虫和抗菌的特性。重要的是要将嘌呤霉素盐酸盐储存在一个密闭的容器中,并置于通风干燥的地方。
盐酸贝斯他汀是氨基肽酶,氨基肽酶B,氨基肽酶M(CD13),和链霉菌来源的亮氨酸氨基肽酶(LAP3)的一种金属蛋白酶抑制剂。这些蛋白的抑制作用是由于肿瘤细胞的凋亡诱导。Bestatin在抗癌化疗、免疫调节、镇痛等方面表现出良好的疗效。
蛋白酶K(又称内肽酶K)是一种从真菌Tritirachiumalbumlimber培养滤液中分离出的胞外内肽酶。这种独特的真菌可以降解角蛋白(因此蛋白酶“K”),并可以利用其副产品作为碳和氮的唯一来源来生长。该酶在较宽的温度和pH范围内是稳定的,在55-65℃和pH8.0时是最佳活性。它在高盐浓度下也很稳定,在强洗涤剂如SDS的存在下也很活跃。其分子量为28.5kDa,对其多肽靶点的特异性较低。
AG蛋白酶K应用于下一代测序(NGS)和微阵列技术•核酸纯化,当从酵母、细菌、哺乳动物细胞和植物细胞裂解物中提取DNA和RNA时,通过灭活核酸酶来纯化核酸•提高PCR产物的克隆效率•使用加速器质谱法对DNA加合物水平进行定量的样品准备•核糖核酸酶保护试验中鸡尾酒酶的失活•添加到提取程序,以优化微阵列研究的原始乳腺肿瘤的RNA产量应用于蛋白质•检测具有独特抗蛋白降解能力的牛海绵状脑病蛋白。•组织消解作为另一种样品制备方法,用于液相色谱-串联质谱定量分析•特异性修饰细胞表面蛋白,分析膜结构进行蛋白定位•生成用于功能研究表征的蛋白片段
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(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代,只要不发生细胞株的基因突变,就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原,获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体,所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,如IRMA和ELISA等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
2.单克隆抗体的局限性
(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应,所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂,而且费时费工,所以单克隆抗体的价格也较高。向左转|向右转
鼠源性抗体应用于人体会产生抗鼠抗体反应(HAMA )等,妨碍其在临床上的应用,所以要制备人鼠杂交和完全人源化的抗体,减少抗体中的鼠源成分,尽量保留原有抗体的特异性.
(1)鼠源单克隆抗体的生产应用的动物细胞工程技术有动物细胞培养、动物细胞融合等.
(2)据图可知,免疫原性的产生主要与抗体的 C区有关.
(3)基因嵌合表达载兼具有淋巴细胞和体细胞的特点,体转染成功的细胞应该具有的特点是:分泌抗体和无限增殖能力.
(4)嵌合抗体的生产属于蛋白质工程范畴.图示中的嵌合抗体具有特异性,能比较有效的治疗肿瘤.
基本原理:抗体分了的特异性识别、抗原结合由轻链和重链可变区决定的,而异源蛋白产生的人抗鼠抗体反应的主要是抗体恒定区。将小鼠单抗恒定区用人源化恒定区代替而拼接成嵌合抗体,使其重链和轻链的可变区来白小鼠,恒定区来自人源性。简言之嵌合抗体既具有抗原结合特异性,又大大地降低了鼠单抗的异源性。嵌合抗体是基因工程抗体最早研究出来的一种抗体,在肿瘤治疗和诊断方法已被广泛的应用。虽然嵌合抗体在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应,但仍存在一少部分鼠源成分。这直接导致抗体被迅速清除,从而降低治疗效果。 1.改形抗体
1986年,Jones等人成功构建了第一个改形抗体,又称CDR移植抗体和人源化抗体,指将鼠单抗可变区中互补决定区(CDR)序列取代人源抗体相应CDR序列,重组构成既具有鼠源性单抗特异性,又保持人抗体亲和力的CDR移植抗体。迄今为止,已有100多种鼠单抗通过CDR移植得到了人源化。基本原理:抗体重链和轻链的可变区主要由CDR和骨架区(FR)组成。其中可变区的6个CDR是负责识别和结合抗原的区域,它们直接与抗原接触,决定了抗体的特异性。骨架区是可变区以外的其它部分,主要起着支持CDR的作用,而且它们的氨基酸组成和排列相对不易改变,因此,可以将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区,就有可能使人单抗获得鼠单抗一样的抗原特异性,并可以最大限度地降低鼠单抗的异源性,这样就得到了改形抗体。与嵌合抗体相比,改形抗体进一步减少了抗体中鼠源部分的比例,降低了人抗鼠抗体,但仍有抗体可能导致抗独特型抗体的产生且存在一些局限性,例如构建方法相对复杂,操作起来费时费力;抗体的晶体结构以及电脑模拟抗体的微细结构上都有很大的问题;降低免疫原性和保持抗原结合活性方面还有很多问题。理所当然,寻找既能实现人源化又可以保持高的免疫学活性的简单易行方法势在必行。
2.表面氨基酸残基人源化一一镶面抗体
1991年由Padlan提出的与CDR移植完全不同的降低鼠源抗体免疫原性的方法。[9]其理论依据是分析了大量鼠单抗可变区和人单抗可变区氨基酸残基的表面暴露情况,结果发现这些暴露的氨基酸残基位置和数量都非常保守,不因为种属和型别而改变。研究表面,这些暴露的氨基酸残基是鼠源可变区免疫原性的主要来源。将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中与人可变区相应的氨基酸残基改为人源的,就可以使可变区表面人源化,消除了异源性而不影响可变区的整体空问构象。
3.表位印记选择
表位印记选择指的是一种与高效筛选噬菌体抗体库技术相结合的人源化抗体的方法,可以通过数论筛选就能得到完全人源的抗体。基本原理:鼠单抗的一个重链或者轻链可变区基因与人源抗体的重链或者轻链的可变区基因文库配对,得到杂合的人鼠抗体库。借助噬菌体抗体库的高效筛选方法,能迅速得到所需抗体,比CDR移植简单且能得到真正的人抗体。缺点:筛选工作量特别大。 小分子抗体顾名思义是分子量较小的抗体片段,它的抗体分子的抗原结合部位仅仅局限于重链和轻链的可变区。虽然分子很小但它既保持了亲本单抗的亲和力具有亲本单抗一样的特异性。种类主要包括:抗原结合片(Fab)抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体、最小,而且识别单位。
1.Fab抗体
Fab抗体为仅含Fab分子,Fab段由完整的轻链(恒定区CL和可变区VLCL)和重链Fd段(第一恒定区CH1和可变区VH)通过一个二硫键连接形成异二聚体,整个分了大小约占总抗体的三分之一,仅含有一个抗原结合位点。将完整轻链和重链Fd的编码基因进行连接,可在大肠杆菌中表达,形成完整的二硫键和立体折叠,可以保存Fab断的功能。常被用于实验室的研究工具。
2.Fv抗体
Fv抗体仅由轻链和重链的可变区组成通过非共价键连接,是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。该片段由于是通过非共价键连接的,所以稳定性不好,十分容易解离。采用适当的方法来解决Fv片段稳定性问题。
3.单链抗体
单链抗体的问世解决了Fv抗体的稳定性问题。它由适当的寡核普酸序列将轻链和重链可变区连接而成,形成单一链的分子,故称为单链抗体。就是单一肤链的结构大大增加了Fv片段的稳定性。相对完全抗体而言,单链抗体在临床上作为治疗剂有好多优越性。但它也有亲和力下降等缺点。
4.单域抗体
单域抗体仅含重链可变区,结构比Fv的亚单位还小,它是一个具有抗原结合活性的分子。同完整抗体相比,单域抗体仍然具有与抗体结合的同等能力及稳定性。
5.最小识别单位
比单域抗体还小的最小识别单位仅含可变区中单一CDR结构,分了量十分小仅占完全抗体的1%左右,亲和力也相当低,所以被命名为最小识别单位。虽然最小识别单位分了量小、亲和力低,但是它具有与抗原结合的能力。 目前,单克隆抗体技术在食品生产加工以及科学研究中得到广泛的应用,食品基质中的细胞、大分子聚介物的小分子半抗原物质均能通过单克隆技术研究或检出。 如,用单克隆抗体技术快速检测食品中的农兽药。单克隆抗体在乳品工业中主要用于牛奶成分分析,尤其对非正常风味牛奶的微生物与酶的鉴定;牛奶中的病原微生物和毒素的检测;加工工艺对牛奶蛋白结构的影响以及牛奶中掺物的识别。向左转|向右转
最近我想筛选一个针对膜蛋白的单克隆抗体,这个抗体的参考文献中提到的一种筛选方法是用DNA质粒直接免疫小鼠,然后再脾融合筛选出来的。这里有几个问题想向大家请教一下:
1.DNA效果比蛋白差很远,但是膜蛋白的抗体有可能是针对空间构象的,能起效的抗体位点很少,所以要在免疫阶段保证抗体多样性和特异性。看参考文献的剂量都是25ug或者50ug这种比较低的剂量,免疫次数2-3次,最后在融合前用细胞加免一次。而我设计的实验组是100ug剂量,免疫了4-5次,我这样是不是筛不出来特异性的抗体了?
2.DNA筛到的阳性抗体,可能亲和力低,如果不想筛到IgM的抗体,DNA免疫从什么时候开始由IgM转换成IgG的?抗体多样性在免疫的什么阶段比较高?
先说骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合,共有3种情况,B淋巴和B淋巴融合,B淋巴和骨髓瘤细胞融合,骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合
第一次筛选是为了筛选出能无限增殖的细胞,这只有两种情况:
1、经过免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞
2、骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞
第二次是为了筛选出能产生单克隆抗体的细胞
那么只可能是,经过免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞。
所以有两次筛选
首先是一个抗体药物的releaselotstest:
?ProteinConcentration----------------------70.9mg/mL[63.0-77.0]
?Potency----------------------100%[80-125%]
?ID(immunoassay)----------------------Pass
?SE-HLC-----------------------MP:99.8%,HMW:0.2%,LMW:0.0%[MP≥99%]
?CE-SDS,reduced----------------------HC+LC:98.9%,HC:66.8%LC:32.1%[LC+HC≥98%]
?CEX-HPLC-----------------------MP:89.6%,Acidic:2.7%,Basic:7.7%[≥80%]
?CEX-HPLCID-----------------------Pass
?Osmolality-----------------------314mOsm/kg[300±50]
?pH----------------------5.2at24.6°C[5.0–5.4]
?Appearance-----------------------Report
?Volume-----------------------1.2mL(average1.1525mL,n=5)[≥1mL]
?Sub-visIBLeParticulate----------------------29particles/container≥10μm[nomorethan6000]
3particles/container≥25μm[nomorethan600]
?Sterility--------------------------------------Pass
?BacterialEndotoxin-----------------------<0.2EU/mL[≤5.0]
?CHOPELISA-----------------------4.4ppm
?Protein-AELISA-----------------------<0.5ppm
?DNAQPCR-----------------------<1pg/mg
以上各项指标基本是反映了对抗体药物最终产品的质量要求,用到的一些方法也比较的明了,可以作为抗体药物开发的参考。
版主zhulikou431留言:
加分鼓励有价值的话题。
单克隆抗体这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题,可用于探讨: ①蛋白质的精细结构;②淋巴细胞亚群的表面新抗原;③组织相容性抗原;④激素和药物的放射免疫(或酶免疫)分析;⑤肿瘤的定位和分类;⑥纯化微生物和寄生虫抗原;⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法 (“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合,将药物带至病灶部位.。
因此,单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究,为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。
一、前言
1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤。
虽然单抗技术已经非常成熟,但是由于其经济价值,仍然有很多人在从事这项研究,而且其中也会遇到很多这样那样大问题。我本人就是其中一个,由于是第一次做单抗,所以过程中遇到了很多困难,终于在前几天得到了几株阳性克隆。
鉴于此,我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来,同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖,希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。