AmSBIo公司于1987年在西班牙马德里组建,在意大利,瑞士和英国开设了多处办事处。AMSBIO是优质生命科学研究试剂和服务的主要供应商,帮助客户开发创新的方法、工艺、和产品。实验室仪器/设备、试剂、细胞库/细胞培养公司位于美国加州,1987年成立于西班牙,历经多年的变动与改革,已成为多样化实验室试剂的供应商;并在全世界建立完整的销售网,提供各地区的实验室完善的销售服务。AMS为基因组学,蛋白质组学和免疫学提供研究产品。产品包括检测套组,基因,核糖核酸,蛋白质芯片,免疫印迹,多克隆抗体,单克隆抗体,抗原与试剂温馨提示:不可用于临床治疗。
AMSBIO的使命是成为生命科学研究试剂和服务的有利可图的首要供应商,帮助客户开发创新的方法,工艺,产品和药物。这是通过向中小型制造商,学术团体和创收生物技术提供独特的全球市场伙伴关系,并为zui终用户和合作伙伴提供先进的技术和成本效益的解决方案来实现的。由SandyAllan和AlexSim于1987年成立,该公司的*家办事处位于西班牙马德里。在接下来的三年中,在意大利,瑞士和英国开设了更多的办事处。在成熟的成长期间,AMS帮助推出了Stratagene和Invitrogen成功的销售活动,为他们提供了发展其全球品牌扩张的重要立足点。AMSBIO与Pharmingen合作,直到1996年出售给BectonDickenson为他们的发展做出了贡献。1995年,AMSBIO从3i和其他私人来源募集资金,以支持将欧洲网络扩展到德国和瑞典,并推出*实时定量PCR平台。1997年,公司重组,导致SandyAllan的离职。仪表部门关闭,瑞典,意大利和西班牙的子公司被出售。的发展 ImmunoKontact(IK)品牌不断与诺华免疫巴塞尔研究所等多家学术机构的许可协议。与IK的发展同步,AMSBIO与Ambion合作,仅在三年内推动欧洲销售额前进了10倍。通过战略安排,该公司协助组建AmbionEurope,zui终将导致Ambion被销售给AppliedBiosystems。AMSBIO从瑞士,德国和英国的设施为欧洲市场服务。后一个位置提供物流和分销服务,以及容纳由具有多年技术经验的科学家组成的多语言营销和技术人员。2003年,AMSBIO设立生产肽的设施,提供杂交瘤和单克隆服务。zui初称为ABE,总部设在瑞士,这些设施已扩大到包括位于南加州和牛津郡的地点。定制服务包括单克隆抗体生产, 定制蛋白质表达 和 多克隆抗体服务。2010年AMSBIO增加了稳定的细胞系生产和慢病毒技术用于shRNA和过表达需求。为全球研究科学市场服务的雄心勃勃的公司需要先进的解决方案,以便能够取得成功并帮助建立关键的群众。目前的amsbio投资组合证明了这一点。AMSBIO专门从事基因组学,蛋白质组学,细胞培养和干细胞科学研究,继续为的制造合作伙伴和学术技术转让部门提供广泛的解决方案。关键领域包括 细胞迁移,入侵,粘附和 增殖,其中适用于高含量分析的多个平台是可用的。3D生长细胞在生理学上是相关的,目前商业上可用于3-D细胞培养的zui具创新性的产品和技术集合已经在AMSBIO伞下放在一起。这些产品被用于重要的再生医学治疗和癌症研究,并提供生物医学研究中使用动物的替代方案。AMSBIO提供来自单一来源的zui大范围的 纸巾产品之一。 RNA, DNA, 蛋白质和组织切片和阵列可以从患病和正常来源获得,并且多种供体提供和预期收集也是可能的。2009年,3i将其在AMSBIO的投资出售给AlexSim,该集团的利益现在代表AMSBIO持有。AMSBIOLLC成立于2011年,以控制南加州的实验室和物流资产。
AMSBIO引入了400多种等基因细胞系,为传统人类疾病模型提供了可靠和有效的替代方案。等基因细胞系可用于模拟任何具有遗传基础的疾病。癌症是等基因人类疾病细胞系模型广泛应用的一种疾病。来自AMSBIO的等基因工程细胞系产品的ISOMAX系列在包括MAPK和mTOR相互作用信号通路在内的各种途径中具有不同的致癌驱动突变。在EGFR、KRAS和BRAF中,超过150个点突变跨越15个基因,如MAPK途径系的不同突变。所有细胞系均可与基因匹配的“正常细胞”一起使用,以提供一个工具集,用于增强我们对癌症生物学的理解,或用于高通量筛选以鉴定癌症治疗剂的铅/靶化合物。使用CRISPR/Cas9技术,这些细胞系没有基因组足迹,这可以影响科学结果,并且不需要选择标记。从单细胞克隆扩增所有细胞系,并通过Sanger测序在基因组水平验证。通过产生突变细胞系的克隆群体,AMSBIO可以确保工程细胞的最高质量和均匀性。除了这个完整的细胞系库,AMSBIO还提供定制的细胞系工程服务。AMSBIO在生理相关细胞培养专业知识的基础上,利用标准细胞系、患者来源和异种移植来源的癌细胞,提供了一种新颖、小型化和高通量的3D离体检测服务,AMSBIO已将等基因细胞系小组纳入其筛选服务组合。该小组代表超过15个临床相关突变。AMSBIO不断与合作伙伴合作,开发用于药物发现和开发的定制等基因细胞系。
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有什么不明白的请追问
我先开个头
泊落沙姆188,土温80
希望得到前辈们的回答。非常感谢!
(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代,只要不发生细胞株的基因突变,就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原,获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体,所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,如IRMA和ELISA等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
2.单克隆抗体的局限性
(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应,所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂,而且费时费工,所以单克隆抗体的价格也较高。向左转|向右转
(1)鼠源单克隆抗体的生产应用的动物细胞工程技术有动物细胞培养、动物细胞融合等.
(2)据图可知,免疫原性的产生主要与抗体的 C区有关.
(3)基因嵌合表达载兼具有淋巴细胞和体细胞的特点,体转染成功的细胞应该具有的特点是:分泌抗体和无限增殖能力.
(4)嵌合抗体的生产属于蛋白质工程范畴.图示中的嵌合抗体具有特异性,能比较有效的治疗肿瘤.
一、前言
1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤。
虽然单抗技术已经非常成熟,但是由于其经济价值,仍然有很多人在从事这项研究,而且其中也会遇到很多这样那样大问题。我本人就是其中一个,由于是第一次做单抗,所以过程中遇到了很多困难,终于在前几天得到了几株阳性克隆。
鉴于此,我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来,同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖,希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。
大家好,最近在做单抗,里面有些问题一直想不通,我想请大神帮忙一下,想问一下饲养细胞加少了是大概多少,我一直6周龄的balb/C,刚拿回来就取饲养细胞了,然后取了3毫升,注射到60毫升的HAT中铺了六块板子,这个量多么,么有细胞计数,至今细胞计数不是很会,去想问你们第二天去看板子是时候,底下会有雾一样的细胞么,细胞多的地方你们的液体上清会有点变色么,要一点不变色的是好的,还是细胞上清稍微变色是正常的呢谢谢大神指导
最近我想筛选一个针对膜蛋白的单克隆抗体,这个抗体的参考文献中提到的一种筛选方法是用DNA质粒直接免疫小鼠,然后再脾融合筛选出来的。这里有几个问题想向大家请教一下:
1.DNA效果比蛋白差很远,但是膜蛋白的抗体有可能是针对空间构象的,能起效的抗体位点很少,所以要在免疫阶段保证抗体多样性和特异性。看参考文献的剂量都是25ug或者50ug这种比较低的剂量,免疫次数2-3次,最后在融合前用细胞加免一次。而我设计的实验组是100ug剂量,免疫了4-5次,我这样是不是筛不出来特异性的抗体了?
2.DNA筛到的阳性抗体,可能亲和力低,如果不想筛到IgM的抗体,DNA免疫从什么时候开始由IgM转换成IgG的?抗体多样性在免疫的什么阶段比较高?
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在过去的20年,单克隆抗体逐渐成为癌症治疗中的支柱。从最初应用价值有限的鼠源单抗到最近新的CAR-T技术,研究者们不停地摸索改进创新。最近一期的《NatureReviewsCancer》杂志刊登了基于单抗的癌症疗法综述。文章从四个方面介绍了单抗在癌症治疗里的用途。
癌细胞靶向疗法:恶性肿瘤细胞表面表达着一些异于普通健康细胞的抗原,这些抗原可以作为单克隆抗体的良好靶点。体外与动物体内的实验显示,针对这些靶点的抗体可以引起细胞的凋亡,并通过补体介导的细胞毒性(complement-mediatedcytotoxicity,CMC)以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)杀死靶细胞。但是在不同临床实验中,具体是哪一种机制更为重要还有待研究.
改变宿主体内应答:VEGF等血管内皮生长因子促进肿瘤内血管生长(angiogenesis),为肿瘤提供优越的生长环境。因此通过抑制VEGF来抑制血管生成的抗体如Bevacizumab等成为有效的抗癌药物。但由于其不能直接作用于癌细胞,此类抗体药物通常与其他具有细胞毒性的药物结合使用。另一个方法是T细胞检验点阻断(Tcellcheckpointblockade)。在T细胞免疫中,配体和受体的共调控在肿瘤特异性T细胞的激活和抑制中起着重要作用。精确控制的T细胞检验点影响免疫系统的反应,避免免疫系统过度激活。抑制这些检验点的单抗被叫做检验点阻断抗体,它们可以诱导更强的肿瘤免疫反应,使反应维持更久的时间。目前常用的抗体包括阻断CTLA4的Ipilimumab和PD1的抗体pembrolizumab和nivolumab。PD1抗体在何杰金淋巴瘤的初期临床实验中显示出很好的效果.
运输具有细胞毒性的分子:近年来,“智能炸弹”(smartbomb)被用来描述这一系列向癌细胞运输细胞毒性分子的单抗。这些分子包括放射免疫偶联物,具有细胞毒性的小分子以及免疫系统里的细胞因子。放射性元素被用于标记抗体,进行肿瘤的诊断和治疗。淋巴瘤是较为适合放射性疗法的癌症,目前被FDA批准的药物有ibritumomabtiuxetan和tositumomab。抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugates)是最近研发的极具前景的抗癌药物。它将带有细胞毒性的药物和具有特异性的抗体偶联,提高了特异性同时更好地杀死肿瘤细胞。此外免疫细胞因子如IL-2和GM-CSF也被结合用在抗体上,用于靶向肿瘤细胞,改变肿瘤微环境.
重塑T细胞:T细胞免疫在肿瘤免疫里起着关键的作用。目前有两大类方法让T细胞不再受T细胞受体识别抗原的MHC分子的限制。第一类方法是双特异性抗体(bispecificantibody),顾名思义,它既可以靶向细胞又可以结合免疫效应细胞,例如T细胞和NK细胞。目前针对CD19抗原的双特异性抗体blinatumomab已经被FDA批准,更多抗体还在研发中。第二类方法是嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcells),即大名鼎鼎的CAR-T细胞。这类被修饰过的T细胞包含具有特异性的抗体可变区和T细胞激活的基序,能够进攻表达特异抗原的细胞。CAR-T细胞可以分裂生长,并保持肿瘤细胞特异性。目前CAR-T细胞疗法在临床实验中取得了非常显著的疗效。尽管随之而来的细胞因子风暴会带来一定危险,不过使用细胞因子的抗体可以减轻它的负面影响。CAR-T实验的经验还在不断积累,未来这一技术将渐渐成熟。
在单克隆抗体制备中,首先进行的就是抗原的设计与合成,这是制备单抗成功与否的关键。因为产生抗体的特异性与亲合性是与抗原密切相关的,合成的抗原如果可以将所需要的抗原决定簇充分暴露出来,那么机体更容易识别抗原决定簇,从而免疫的动物所产生的抗体自然会在特异性和亲合力上最大程度的与抗原决定簇拟合。所以,在制备单抗的过程中,设计并合成抗原尤为重要。
对于小分子药物抗原的设计与合成,园子里已经有很多战友进行了讨论和交流,下面,我再将自己所了解的结合战友们的经验,作以下总结,由于能力有限,有总结的不到位的地方,还请战友们指出来,不足的地方,大家一起讨论补充。
一、完全抗原的设计
大家都知道,完全抗原的合成主要是在半抗原的基础上连接上蛋白质形成的,主要原因在于,半抗原属于小分子药物,只有反应原性,但不具有免疫原性,只有与载体(通常为蛋白质,也有多肽)偶连后形成完全抗原,才具有免疫原性,进入动物体内后才会产生抗体。对于半抗原而言(大多数为小分子药物),不同种类药物有不同的空间结构,究竟如何设计合成完全抗原呢?
1、分析药物结构。以磺胺对甲氧嘧啶(SMD)为例,磺胺药物的母体为对氨基苯磺酰胺,大部分的磺胺药是在N1端连接了取代基,N4端为氨基。也就是说各种药物由于N1端取代基的不同从而具有不同的活性,那么对于制备抗SMD的抗体而言,其抗原的合成就可以选择在N4端连接蛋白,将N1端的对甲嘧啶环暴露出来,这样免疫后就可以使机体产生针对SMD的抗体。如果是在N1端连接,那么半抗原突出的是磺胺类药物共有的对氨基磺酸母核,这样制备出的抗体其交叉性就会较大,更易识别磺胺类的其他药物了。
所以,在设计之前应该认真分析需要合成的抗原结构,找出起抗原活性的位置及其抗原决定簇的位置。
2、设计合成的原则:免疫半抗原设计的基本原则是免疫半抗原与载体连接后在结合抗原中能最大程度保持和突出待测物的特征结构,特别是立体结构。
3、“间隔臂”。免疫半抗原一般有几结构组成:待测物特征结构、用于连接特征结构和载体的间隔分子和末端的活性基团。间隔分子又称为”间隔臂“。免疫系统对位于载体远端的半抗原部分识别能力最强,所以间隔臂的位置选择十分重要。间隔臂的位置结构最能体现一种免疫半抗原的设计意图。一般我们可以直接利用待测物中非特征的结构部分作为间隔臂或自行构建间隔臂。通常间隔臂为非极性,除供偶连合成的基团外不应含有其他高免疫活性的结构,如苯环、杂环、饱和链烃等。
有的人认为,引入间隔臂对抗体的产生反而有干扰,假若间隔臂较长,或立体结构较特征性,则很容易产生针对间隔臂的“桥抗体“,在单抗的筛选过程中会产生干扰。但是,有的药物由于分子量小、空间结构简单,很难通过单纯的连接蛋白产生高效特异的抗体,所以,引入间隔臂会有利于抗体的产生。
二、完全抗原的合成:
常用的载体蛋白中,供连接的主要基团为游离氨基、游离羧基、酚基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基、精氨酸的胍基等。但由于蛋白质载体参与反应的基团差不多相同,所以连接方法主要取决于半抗原活性基团种类。
1、含羧基的半抗原:主要有混合酸酐法、碳二亚胺法、N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法(NHS)。该法的优点在于不含有间隔臂,可以排除“桥抗体“的产生。
2、含氨基的半抗原:有戊二醛法(含有戊二醛,容易产生“桥抗体“)、重氮法(不含间隔臂)。
3、含羟基的半抗原:主要有琥珀酸酐法、卤代羧酸法。
此外,还有含巯基、醛基或酮基、硝基的半抗原,其偶连方法这里不再赘述,大家可以参考洪孝庄的《蛋白质连接技术》。、
三、完全抗原合成的鉴定:
可以采用紫外分光光度法、红外光谱法和免疫实验的方法来进行鉴定偶连反应是否成功。
半抗原结合比的计算:即指半抗原与载体的连接比。一般认为,半抗原结合比过高或过低均影响抗体生成,以5-15为宜。但,有些研究者的实验结果表明,半抗原结合比的大小对诱导抗体产生无决定性的影响。可以通过反应原料中蛋白质与半抗原的摩尔比和溶液的PH来控制结合比。
半抗原结合比=(ε结合物-ε载体)/ε半抗原
(ε为某波长的摩尔吸光系数,取载体、半抗原和结合物均有较强吸收时的波长;ε载体、ε半抗原可预先用纯品检测得到)
以下整理了园子里一些小分子药物抗原设计与合成方法的帖子,大家可以参考:
【求助】关于莱克多巴胺的人工抗原合成。特急!(戊二醛法)
[交流]单抗讨论小组话题三:小分子抗原的单抗制备策略
(请教)人工抗原怎么制备
【讨论】为什么小分子一般连接BSA免疫偶不是连其他蛋白啊
【求助】l氯霉素半抗原的合成
【讨论】氯霉素人工抗原偶联率的计算
【求助】氯霉素人工抗原制备过程中的问题
Re:【求助】请教:戊二醛法合成完全抗原时遇到的问题(合成SMM)
Re:【交流】小分子药物的蛋白质连接技术(精华帖)
(请教)如何产生较高效价抗青霉素抗体
Re:【求助】重氮法制备人工抗原遇到的问题
由人源化和全人源抗体制备的人源化和全人源抗体药物因其具有高亲和力、高特异性、毒副作用小的特点,克服了动物源抗体及嵌合抗体的各种缺点,已经成为了治疗性抗体药物发展的必然趋势。
阿达木单抗作为生物单抗药物,在疗效和技术门槛方面难以挑战;另外,越来越多的医生在治疗类风湿时首选皮下注射给药的剂型,不需要注射过程和费用,虽然与依那西普的对比临床试验还未出来,但是人们普遍认为阿达木单抗的疗效更好。向左转|向右转