最近我想筛选一个针对膜蛋白的单克隆抗体，这个抗体的参考文献中提到的一种筛选方法是用DNA质粒直接免疫小鼠，然后再脾融合筛选出来的。这里有几个问题想向大家请教一下：

1.DNA效果比蛋白差很远，但是膜蛋白的抗体有可能是针对空间构象的，能起效的抗体位点很少，所以要在免疫阶段保证抗体多样性和特异性。看参考文献的剂量都是25ug或者50ug这种比较低的剂量，免疫次数2-3次，最后在融合前用细胞加免一次。而我设计的实验组是100ug剂量，免疫了4-5次，我这样是不是筛不出来特异性的抗体了？

2.DNA筛到的阳性抗体，可能亲和力低，如果不想筛到IgM的抗体，DNA免疫从什么时候开始由IgM转换成IgG的？抗体多样性在免疫的什么阶段比较高？

实验外包单克隆抗体在现代生物医学中的作用越来越大，它不仅被广泛应用于生化和免疫检测，而且治疗癌症和自体免疫疾病的单抗药物也逐渐批准上市。因此单抗的制备和筛选具有其内在的重要性。

动物免疫

取4只6周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射抗原（20μg/只），第一次免疫与等量弗氏完全佐剂乳化，0.2mL/只；两周后进行第二次免疫，抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，皮下注射，0.2mL/只；两周后进行第三次免疫，免疫方法及剂量同第二次免疫。第三次免疫一周后，小鼠眼眶采血测其效价，第三次免疫两周后，选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的抗原加强免疫，3d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。

细胞融合

1骨髓瘤细胞的准备

选择生长状态良好的SP2/0细胞，覆盖瓶底80％时弃上清，以不完全培养基洗涤一次后，用l0mL不完全培养基将细胞轻轻吹下。

2脾淋巴细胞的准备

取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈脱臼将小鼠致死，用75%酒精消毒体表10min，随即放入超净台内的解剖板上，腹部朝上，四肢固定；无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织；随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。用研磨棒挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。

3饲养细胞的制备

取一只成熟健康的ICR小鼠，摘眼球采血作为阴性血清，颈脱臼处死；体表消毒和固定后，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜；用l0mL注射器，12#针头，吸取10mLHAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入己准备好的容器中。

4融合

将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的融合管中，1000rpm离心10min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37°C水浴中45s内缓慢加入1mL预热的PEG-1500到融合管中，边加边轻轻摇匀；随即在90s内先慢后快滴加30mL37°C预热的不完全DMEM培养基，使PEG稀释而失去作用，37°C静置10min，1000rpm离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞；分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37°C6%CO2培养箱内培养；5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10d后用预热的HT换出HAT；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行ELISA检测,两次检测结果为阳性设为阳性克隆孔。

杂交瘤细胞的克隆化及建株

采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化。阳性细胞计数，取100个细胞放入5mL含饲养细胞的培养液中，即20个细胞/mL，100μL/孔滴加于96孔细胞培养板，即每孔1个细胞：再将余下的细胞悬液倍比稀释，细胞数为10个/mL，100μL/孔滴加于96孔细胞培养板，即每孔0.5个细胞。第8～9d时，肉眼可见细胞克隆，对出现单个细胞克隆的孔再按筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA方法进行筛选。连续进行三次以上亚克隆，判为阳性的细胞株扩大培养，建株冻存。