3、杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯净而定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的，100%的抗原参与反应，一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面，如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原，检测系统可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为10：1，最好为100：1。另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A的检测方法。下面简要介绍几种常用的抗体检测方法：⑴免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。A、器材和试剂a.包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/LNa2CO38ml，0.2mol/LNaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/LTris100ml，0.1mol/LHCl58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。b.洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO40.2g，KCl0.2g，Na2HPO4•12H2O2.9g，NaCl8.0g，Tween-200.5ml，加蒸馏水至1000ml。c.稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。d.酶反应终止液（2mol/LH2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。e.底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/LNa2HPO425.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。f.底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD5mg，底物缓冲液10ml，3%H2O20.15ml。TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1%H2O225ul。ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS0.5mg，底物缓冲液1ml，3%H2O22ul。g.抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。h.抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。病毒感染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。i.酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。j.细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4100mg，KH2PO4500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。k.聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。l.酶联免疫阅读仪；或光镜。m.吸管、加样器及水浴箱、离心机等。B、可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）a.纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。b.以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。c.弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。d.每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。e.洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。f.每孔加50-100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。g.加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。h.加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分钟。i.以2mol/LH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。j.结果判定：以P/N≧2.1，或P≧N+3D为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。C、全菌抗原的ELISASa.新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮，并调整细菌浓度至1×108个/ml。必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作，最好是灭活处理。b.每孔中加100ul5%戊二醛溶液（0.1mol/LNaHCO395ml+25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次；加上述细菌悬液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃2小时封闭。c.步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃预冷的无水甲醇室温作用15分钟，蒸馏水洗涤3次；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃2小时封闭。d.洗涤液洗3次；此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。e.以下步骤同上法。D、用全细胞抗原的ELISAa.按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液。b.淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm离心30分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液。该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0.83%的氯化铵溶液，室温10分钟，洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。c.每孔加100ul上述a或b的细胞悬液，使每孔含细胞5×104个；1500r/min15分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分钟；可4℃或-20℃保存备用。d.以下步骤同上法。E、抗体捕捉ELISA试验本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体捕捉待检样品中的McAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。该法是常用的ELISA中较理想的一种；其操作步骤如下：a.以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板，每孔加100ul，37℃2小时或4℃过夜。b.洗涤、拍干后加待测的McAb样品，37℃1-2小时。c.洗涤后加适量的抗原，37℃1-2小时。d.洗涤后加入酶标多克隆抗体，37℃1-2小时。洗涤后加底物显色，判定结果。F、ABC-ELISA试验ABC-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，增加了生物素（Biotin）与亲和素（Avidin）间的放大作用。亲和素有4个亚单位组成，对生物素有高度的亲合力。生物素很易与蛋白质共价结合。因此，结合了酶的亲和素与结合有抗体的生物素发生反应即起到了多极放大作用。其操作步骤如下：a.已知抗原的包被及加待检McAb样品，同间接ELISA试验。b.加生物素化抗鼠Ig抗体，每孔100ul，37℃1小时；洗涤。c.加酶标亲和素，每孔100ul，37℃30分钟洗涤；加底物显色，判定结果。G、Dot-ELISA试验免疫斑点试验（Dot-ELISA）是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为固相载体，进行抗原抗体反应的免疫检测手段。该法采用不溶性底物（如DAB，或4-氯萘酚或AgNO3等），其与相应标记物（HRP、AP、胶体金）作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色，从而易于判定结果。根据所用的标记物不同，可分为HRP免疫斑点试验、AP免疫斑点试验和免疫金银斑点法等。其操作步骤大致如下：a.将抗原液2-5ul点加于纤维素膜上，室温37℃干燥。b.将纤维膜浸入封闭液中，37℃30分钟。c.用洗涤液洗2次，吸干后加待检McAb样品，37℃1小时；用洗涤液振荡洗涤三次，每次5分钟，加HRP或AP或胶体金标记的抗鼠Ig抗体，37℃作用30分钟。d.同法洗涤，吸干，用新配的相应底物溶液显色，然后水洗终止反应，观察结果。H、免疫组化染色法该法主要用于检测针对细胞抗原成分的McAb，常用的方法是间接免疫过氧化物酶试验（IIP，indirectimmunoperoxidase）及APAAP技术。其结果用光镜或倒置显微镜检查。⑵免疫荧光技术免疫荧光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测，如细胞性抗原（包括细菌和动物细胞）、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作简单、敏感性高，可直接观察抗原定位等优点，在McAb的筛选与鉴定上具有重要的应用价值。A、器材和试剂a.供检测抗体用的抗原制备—固定细胞片或板，活细胞悬液。b.PBS（PH7.2，0.01mol/L）c.待检的McAb样品。d.冷丙酮e.FITC（异硫氰酸荧光素）或TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素）标记的抗鼠Ig抗体等f.荧光显微镜，磁力搅拌器，离心机，水浴箱等。B、间接免疫荧光法a.固定细胞片的制备：生长在盖片上的细胞（接种或未接种病毒），可直接收获盖片，在PBS中洗涤，用4℃丙酮固定10分钟，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用；单细胞悬液可在盖片上制成涂片，固定方法同上。细胞涂片的制备：将10ul细菌悬液（1×108个/ml）涂抹7×21mm盖片上，自然干燥后，用-20℃丙酮固定10-15分钟，于-20℃保存备用。b.盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10-20ul杂交瘤上清或其他待检样品；设立阳性、阴性对照；置37℃水浴孵育0.5-1小时。c.取出盖片置PBS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。d．盖片置架上，滴加工作浓度的抗鼠Ig的荧光抗体10-20ul，37℃孵育0.5-1小时。e．同法洗涤15分钟；取出盖片，用延缓荧光碎灭的封载剂（如缓冲甘油，9份甘油加1份PBS）封于干净载玻片上。f.光显微镜上观察，阳性结果可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光，TRITC为桔红色荧光）。g.细胞固定片的制备，也可改在培养板孔中进行，其余步骤同上，在观察结果时，将培养板翻转置于荧光显微镜下，判断标准不变。C、细胞的膜荧光染色完整的活细胞的细胞膜，抗体不能透过。如果细胞在4℃操作，则荧光染色仅限于细胞膜。必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体，因此试验过程中要保证细胞的高活力。活细胞的膜荧光染色大致步骤如下：a.制备活性较好的细胞悬液，调节浓度至107个/ml。b.在小试管（5×50mm）中加入100ul细胞悬液，再加入100ul待检McAb的样品，混匀，4℃作用30-90分钟。c.用洗涤液（PBS900ml，小牛血清50ml，4%NaN350ml）洗二次，每次加洗涤液1-5ml，1000r/min离心5分钟，弃上清。加入100ul荧光抗体，4℃作用30-90分钟。d.同法洗涤，将细胞重新悬于20-30ul含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中；滴加于载玻片上，加盖片封载。e.立即在荧光显微镜上检查。f.细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定，立即检查，或至少在4℃可保存一周。⑶间接血凝试验间接血凝试验又称被动血凝试验（PHA），是目前应用较广的检测方法之一。本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上的抗原产生特异性反应时，导致红细胞呈凝集现象。可见，该法具有灵敏、快速、容易操作和无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，克服原来重复性差的缺点。A、器材和试剂a.绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。b.缓冲液：PBS（PH7.2）；醋酸缓冲液。c.甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝剂等。d.血凝板，振荡器等。B、多糖抗原的间接血凝试验a.甲醛化绵羊红细胞的制备：无菌采集绵羊颈静脉血50ml，用枸橼酸钠作抗凝剂；用5倍于红细胞压积的PH7.2PBS（Na2HPO4•12H2O3.58g，KH2PO40.41g，NaCl8.01g，蒸馏水1000ml）充分洗涤5次，每次1500r/min5-10分钟，直至上清测定无蛋白质（用饱和硫酸铵滴定上清，观察有无白色沉淀），再以相同缓冲液配成25%红细胞悬液；将25%红细胞悬液与20%甲醛以2.5：1的比例混匀，37℃水浴作用2小时，每15分钟振荡一次，红细胞颜色逐渐由鲜红色转变为棕色；以PH7.2PBS洗涤4次，每次2000r/min10分钟，再以同样的PBS制成25%红细胞悬液；其后，重复醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化绵羊红细胞悬液，加甲醛至0.3%防腐，4℃保存备用。b.脂多糖抗原致敏甲醛化绵羊红细胞的制备：取脂多糖（LPS），以0.2mol/LPH8.0PB液，调整多糖浓度至120ug/ml，然后100℃水浴处理1小时；将冷却至37℃的热处理LPS与6%醛化红细胞等量混合，37℃搅拌作用45分钟；取出离心2000r/min10分钟，以0.01mol/LPH7.2PBS洗涤4次；配制成4%致敏血球，分装，保存于4℃备用，或冻干保存。c.McAb的筛选：取待测McAb样品25ul，加入V型微量血凝板孔中，同时设立阴性、阳性对照；再加入0.5-4%致敏红血球悬液25ul，在振荡器上混匀30秒；置室温或37℃30-60分钟观察结果。阴性对照孔应呈紧缩的圆点。C、可溶性蛋白抗原的间接血凝试验a.红细胞醛化：采用双醛法。采绵羊或人“O”型抗凝血，每次加10倍于红细胞压积的PBS洗涤4-6次，然后配成8%红细胞悬液；向此8%红细胞悬液缓慢加入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS，于室温缓慢搅拌17小时；其后洗涤3次，配成20%双醛化红细胞悬液，加0.1%NaN3防腐，4℃保存备用。b.致敏红细胞：取20%双醛化红细胞0.1ml，1500r/min10分钟，弃上清，沉积红细胞加0.2mol/LPH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液1ml，并加最适浓度（应预先测定，蛋白抗原为50ug/ml左右）的抗原1ml，混匀，于45℃致敏30分钟，有时轻轻摇动，使红细胞不下沉。然后离心去上清，并用20倍于红细胞压积的PBS洗3-4次，最后用PBS配成0.5-1%致敏红细胞，4℃保存备用。c.McAb测定：同上法。⑷放射免疫测定放射免疫测定是用放射性同位素标记抗原或抗体，以检测相应抗原或抗体的定量方法。在筛选和鉴定单抗时常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以检测样品中的McAb，其操作步骤如下：a.用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至适宜的浓度（1-100ug/ml），滴加聚乙烯微板孔内，100ul/孔，4℃过夜或37℃2小时。b.弃去抗原液，每孔加100ul含0.5-1%BSA的PBS，4℃1-2小时封闭。c.用BSA-PBS洗涤3次，每次3分钟。d.加待检样品，每孔100ul，设立阴性孔、阳性孔和空白孔；37℃1-2小时，同法洗涤。e.每孔加125I标记的抗鼠Ig抗体工作液100ul，37℃1-2小时，同法洗涤。f.用γ-射线闪烁计数仪分别测定各孔放射性。通常要求样品孔和阳性对照孔的放射性脉冲分别超过本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性为基准，凡样品孔与阴性孔放射性之比大于3的样品定为阳性。