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实验方法原理 | 亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白,对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样,结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应,既起到了多级放大作用,又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色,达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。 | ||||
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实验材料 | 生物素化抗体 试剂、试剂盒 | 酶标记的亲和素 实验步骤 | 1. 包被抗体:用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释,在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1ml,于4℃过夜(18~24h)。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3min(简称洗涤,下同)。 2. 加样:加入待检样品(未知抗原)或作适当稀释的标准参考品于反应孔中,同时作空白孔、阴性和阳性孔对照。37℃孵育1h,洗涤。 3. 加B-Ab:已作适当稀释的生物素化抗体(B-Ab),每孔加0.1ml,37℃孵育30~60min。洗涤。 4. 加A-HRP:已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素(A-HRP),每孔加0.1ml,37℃孵育30~45min。洗涤4次。 5. 底物显色:于上述各反应孔中加入临时配制的TMB(或OPD)底物应用液0.1ml,于37℃孵育10~30min。再加2mol/LH2SO40.05ml以终止反应。 6. 结果判定:目测或在ELISA比色仪上测OD值(见ELISA部分)。 |
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发布于 : 2018-08-07
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