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技术原理
同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；还可以加入荧光探针（分子信标），带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由实时荧光PCR仪实时捕获，直观反映扩增循环情况。

SAT检测技术的优势
→先进的恒温扩增技术
核酸扩增在一个温度下进行（42℃），无需热循环。
→领先的RNA检测技术
SAT技术直接以病原体特异性RNA为扩增靶标，以扩增产物RNA为检测靶标，在实际应用中更显优势意义。
→更高的检测灵敏度和准确性
SAT技术的扩增效率极高，15～30分钟即可将模板扩增109倍，检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术。扩增时间短，效率高。
→有效减少假阴性结果
SAT技术采用M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，有效减少假阴性结果。
→有效的解决了扩增产物的污染问题
由于扩增产物为RNA，环境中极易降解，从而大幅度提高检测结果的可靠性。
→大大降低了核酸扩增实验室的要求

三步法PCR 首先95°C 作用3 min。 PCR 进行 35 个循环。 步骤 温度 变性 95°C 退火 58°C 延伸 72°C 时间 30 秒 30 秒 30 秒 融解曲线 温度 时间 变温速度 95°C 0秒 20°C/秒 55°C 15 秒 20°C/秒 95°C 0秒 0.1°C/秒 PCR 疑难解答 当 PCR 结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行： 1 将 PCR 反应的试管与反应板紧贴。 2 当酶反应混合物以 70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍 3 微振荡一 下，因为在 0.2-ml 的 PCR 管中不能均匀传热。 4 不要随意减少 dNTP 的用量， 它是一个系统的因素， 必须与其它成份保持平衡。

你这个结论并不对。两步法，三步法并没有本质区别，信号的读取都是在每一个延长结束后读取。定量PCR一开始的时候也是三步法的。

两步法，是因为设计引物的时候把退火温度设为酶的工作温度，而且定量PCR的产物都很短，需要的时候都短，所以两步法更方便。三步法的话，花的时间长，不利于快速实验。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
恒温PCR和实时荧光定量PCR的不同，是不同在实时荧光定量PCR的系统中加入了荧光染料（SYBR Green 或Taqman 探针等等）。以SYBR Green为例，这种染料可以结合在双链的DNA上，当PCR不断进行时，每一次退火生成的双链DNA也在增加，荧光染料结合也越多，荧光也越强。在机器中有一个探测荧光的探头，可以定量检测荧光的强度，转换成数值。这样就可以实时记录反映体系中DNA的反应情况。
荧光PCR更有优势，因为荧光PCR灵敏度高于恒温PCR，同样价格也高一些。

本人最近接触荧光定量PCR上机之后图片是这样的不知道问题出在哪里希望有老师可以帮忙看一下谢谢第一个和第二个图片是目的基因第三个是内参

目前各家仪器公司推出自己的数字PCR，目前市场主流的是三家，1、LIFETechnologies3D数字PCR（芯片式数字PCR）：我个人认为是微孔数字PCR，主要是将20ul反应体系分散到20000个微孔中进行反应,变成20000个反应体系，PCR反应结束后，采用CCD拍照，数阳性反应孔。2、Bio-Rad的微滴数字PCR（油包水原理）：将20ul反应体系采用液滴反应器形成20000个油包水反应体系，PCR反应结束后，才有流式细胞术的原理，检测每一个液体，数阳性反应的液滴数量。3、RainDance的数字PCR（油包水原理）、原理与伯乐微滴数字PCR相同，但是其液体形成能力比伯乐强很多，理论上可以产生1000万个小油滴。价格从高到底：Raindance、Bio-Rad、LIFETechnologies。目前本人使用的是Bio-RadQX200、正在做实验室，希望广数字PCR的使用者可以相互交流，相互解答疑问，更好的利用数字PCR。

1．目的
学会PCR操作的基本技术。

2．原理
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中<25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。

3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。

4．试剂
5U/μlTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2free），25mMMgCl2，dNTP，引物，模板质粒pBS-CHI，无菌ddH2O。

5．实验准备
dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，荧光染料，10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。合成的引物：Senseprimer5＇-GGATCCACAATGATGAGAGCC-３＇
Antisenseprimer５＇-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-３＇

目的基因模板质粒：已经克隆在pBS载体上的1128bp几丁质酶（chitinase，CHI）基因。
待扩增的CHI片段长度：996bp。

6．操作步骤
（1）在0.2mlPCR微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）
ddH2O32μl
10×PCRbuffer（不含MgCl2）5μl
25mMMgCl23μl
2.5mmol/LdNTP4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/LPrimer12μl（12.5~25pmoles）
10μmol/Lprimer22μl（12.5~25pmoles）
模板质粒1μl（1×10-3pmoles）
5U/μlTaq酶1μl（5U）
总体积50μl

（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
①94℃5min
②94℃1min
③54℃1min
④72℃1min50s
⑤goto②29times
⑥72℃10min
（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（4）清理桌面，撰写实验报告。
（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。

7．思考
（1）复性温度如何确定？
（2）为什么要在最后延伸10min？
（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？

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本人之前尝试过用普通的Taq酶扩增2kb的条带，但是老是扩不出来。:(我想问一下各位老师有没有试过用普通的Taq酶扩长片断呢？另外还有个问题就是要是我用PrimeSTARTMHSDNApolymerase可以扩出长片断吗？谢谢。

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请问大家谁有数字PCR相关的资料，可不可提供一下啊，谢谢

交叉引物恒温扩增技术
核酸扩增是核酸分子诊断的关键技术。根据核酸扩增反应中温度变化要求，可以将核酸扩增技术分为两大类：一类是PCR核酸扩增技术，另一类是核酸恒温扩增技术。
PCR技术是指通过控制温度的变化来实现DNA扩增的三个步骤：模板变性（如95℃）－引物杂交（如58℃）－DNA合成（如72℃）。这种温度变化的循环重复（如重复35次）过程通常由精密而复杂的仪器（PCR仪）来控制。核酸恒温扩增技术（NucleicAcidIsothermalAmplification，NAIA）则是扩增反应的全过程均在同一温度下进行，不须象PCR反应那样需要经历几十个温度变化的循环过程。这一特点使得它们对扩增所需仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，因而具有巨大的应用价值，成为分子诊断行业发展中的热点。
目前的NAIA技术主要有滚环扩增技术（RollingCircleAmplification，RCA）、转录酶扩增技术(TranscriptionMediatedAmplification，TMA)、依赖核酸序列扩增技术(NucleicAcidSequenceBasedAmplification，NASBA)、链置换扩增技术(stranddisplacementamplification，SDA)、环介导的等温扩增技术（Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP）、解链酶扩增技术（HelicaseDependentAmplification，HDA）。上述各种核酸扩增技术均由国外公司所拥有。
交叉引物扩增技术（CrossingPrimingAmplification，CPA）是完全由优思达公司独立研发成功的一种新的核酸恒温扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。CPA与优思达公司其他技术相结合(如快速核酸提取技术、核酸试纸条检测技术等)，形成一个完整的现场快速分子检测平台，可以开发出众多恒温扩增检测试剂盒，广泛应用于分子诊断、防疫检疫、生物医学研究、个体化治疗等领域。该技术已申请中国和美国发明专利，在美国《MolecularDiagnostics》等杂志发表论文二篇，并通过了比尔?盖茨基金会资助申请。
CPA扩增体系中除包含具有链置换功能的BstDNA聚合酶外，还主要包括扩增引物和两条交叉引物。这些寡聚核苷酸链能依靠BstDNA聚合酶的高活性的链置换特性，使DNA的循环扩增能不断的实现。CPA扩增主要包含以下几个步骤：
交叉正向引物CPF中的PFs与模板DNA中PFa互补，启动DNA合成，使得PRa被引入到所扩增的产物中;
外围引物DP1s与PFa前端DP1a序列互补，通过链置换型DNA聚合酶向前延伸，一边置换CPF合成的能与CPR和DP2a结合的单链产物（结构3），一边与模板DNA形成双链产物（结构2）;
在结构3中，DP2a通过链置换型DNA聚合酶向前延伸，置换出由CPR所延伸的单链产物（结构5），同时合成与步骤2中由CPF延伸所产生单链DNA形成双链产物（结构4）,而结构5相对起始的DNA模板，多了PRs和PFs两个片段序列;
单链结构5中的3’端的PFa和PRs可分别与CPF中的PFs和CPR中的PRa互补结合，可在链置换型DNA聚合酶的作用下延伸和置换出相应的单链产物。延伸产物相对结构5来说又增加了一个PFs区域（结构8）;
因此，扩增引物CPF和CPR的不断杂交和延伸，不仅使得结构5的长度不断的加长,从而引入更多CPF和CPR3’端互补区域，同时也置换出了各种可与CPF和CPR3’端互补的单链产物;
通过CPF和CPR的不断杂交延伸和DNA聚合酶的链置换作用，使得DNA拷贝数不断的增加，从而达到基因扩增的效果。
使用本装置提取临床生物样品的核酸成本低廉，只需几分钟，可以应用于现场检测或实验资源较少的基层医院和经济不发达地区；同时也可以满足大医院特定情况下的需求，如急诊或床边的核酸快速诊断。该技术已申请发明专利，并取得盖茨基金会研发资助。
CPA基本原理如下：

图2CPA扩增的反应原理图
与目前广泛使用的荧光PCR技术相比较，CPA技术有以下几个优点：
反应速度快：反应时间约1小时，使试剂盒可用于检验检疫、突发性传染病的检测与监控现场检测或医院的床边诊断（Point-of-Testing,POCT）；
检测成本低：目前荧光光定量PCR仪价格昂贵，无法在很多中小医院普及。CPA扩增只需要离心机和一台简单的恒温装置，如普通的水浴锅、金属浴，即可进行扩增。
操作简单：对操作人员的技能要求不高，绝大多数人通过简单培训或自学都可掌握，为核酸检测试剂的广泛应用创造了条件。

如果有标准曲线，按照标准曲线计算。
一般都是相对量。则用delta delta CT方法来计算。举例如下：
对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。
首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。

几点注意：
1。必须确定扩增的特异性
2。 只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同）
3。 2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2。
4。 最好不用Syber Green