| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | DNA库不含甲硫氨酸的翻译混合物 试剂、试剂盒 | MgCl2核苷三磷酸溶液转录缓冲液去离子超滤水T7RNA聚合酶固体EDTA尿素缓冲液NaCl乙醇EDTAATPT4多核苷酸激酶缓冲液T4多核苷酸激酶T4DNA连接酶缓冲液T4DNA连接酶乙酸钾溶液兔网织红细胞裂解物翻译试剂盒氯化钾乙酸镁不含核酸酶的水兔网织红细胞裂解物35S甲硫氨酸对照RNA 仪器、耗材 | 电洗脱仪变性PAGE胶胶凝胶过滤柱（Pharmacia） 实验步骤 | 实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1.如下在冰上配制1ml转录反应混合物，最后加入T7RNA聚合酶： DNA库（终浓度为5～50nmol/L） 35ul1mol/LMgCl2 50ul各成分为100mmol/L核苷三磷酸混合物（各NTP终浓度为5mmol/L） 100ul10×转录缓冲液（最终为1×） 加入去离子超滤水补至980ul 20ul10U/ulT7RNA聚合酶（最终为200U/ml） 转录反应于37℃孵育3～16h。用冰上冷却或加入固体EDTA至终浓度50mmol/L以终止反应。 2.用变性PAGE纯化所得的RNA。往转录反应中加入固体尿素至5mol/L、加入EDTA至50mmol/L，于90°C加热2min，上样到变性PAGE胶上。 3.电泳结束后，紫外照射显影并割下纯化的RNA条带。通过被动洗脱将RNA提取到300mmol/LNaCl溶液中或用电洗脱仪并按厂家的说明将RNA洗脱到0.5×TBE中。 4.加入3mol/LNaCl（终浓度300mmol/L）和2.5倍体积的乙醇沉淀RNA。于-80℃冷冻20min或于-20℃冷冻过夜。 5.于4℃，12000g离心10min弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，抽干，溶于0.5ml去离子超滤水中，用紫外-可见分光光度计测量260nm的吸收值以测定浓度。 6.合成接头，即3"端为嘌呤霉素的DNA寡核苷酸，长度约为30核苷酸，「无结构」 例a.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCP 例b.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA999ACCP 在例b中，「9」是指phosphoramiditespacer9（GlenResearch），「P」指嘌呤霉素，来源于CPG-嘌呤霉素（GlenResearch）。该接头能得到高显示的蛋白质产量。以嘌呤霉素为末端的DNA寡核苷酸是用变性PAGE胶纯化，从胶里回收，然后如前所述沉淀下来。将DNA接头溶解于去离子水中并用紫外-可见分光光度计测量260nm的吸收值以测定浓度。 7.用多核苷酸激酶憐酸化DNA接头的5"端，1ml激酶反应体系如下： 300ul100umDNA接头（终浓度30um） 10ul100mmol/LATP（终浓度1mmol/L） 100ul10×T4多核苷酸激酶缓冲液（终浓度1×） 490ul水 100ul10U/ulT4多核苷酸激酶（最终为200U/ml） 8.反应混合物在37°C孵育2h，加入200ul100mmol/LEDTA，90℃加热5min，然后用凝胶过滤柱脱盐。 9.合成splint。splint是一种DNA寡核苷酸，其序列为（从5"端起）与RNA库的3"端互补的≥10核苷酸加上与接头5"端互补的≥10核苷酸，通常为T10。用变性PAGE纯化。 10.如步骤3从凝胶提取、如步骤4沉淀DNA。 11.用去离子水溶解纯化的splint并用紫外-可见分光光度计测量260nm的吸收值以测定浓度（见步骤5）。 12.在splint存在下用T4DNA连接酶连接接头和RNA模板以产生mRNA显示模板。配制下列1ml连接反应体系： 100ul100umol/L5"磷酸化的DNA接头（最终为10um） 100ul100umol/LRNA库（最终为10um） 100ul100umol/Lsplint（最终为10um） 580ul水 13.混合物加热到95℃放置2min，然后加入10010×T4DNA连接酶缓冲液（最终为1×） 14.将所得混合物涡旋振荡，置于冰上冷却10min，然后使其升至室温后加入20ul2000U/ulT4DNA连接酶（最终为40U/ml）。 15.反应体系在室温下孵育20min。加入150ul100mmol/LEDTA和500mg固体尿素，90℃加热5min。 16.用变性PAGE胶纯化连接好的mRNA显示模板，胶回收（见步骤3），然后如步骤4沉淀，但是改用3mol/L乙酸钾（pH5.3）代替3mol/L氯化钠。 17.用去离子水溶解纯化的mRNA显示模板并用紫外-可见分光光度计测量260nm的吸收值以测定浓度。 在mRNA显示模板用于大规模翻译之前，应当尝试一并进行各种对照组的小规模翻译以有助于在蛋白胶上鉴别mRNA展示蛋白所对应的条带。 18.在冰上配制翻译反应体系，最后加入兔网织红细胞裂解物。 19.于30℃孵育1h，然后往各反应体系中加入1.7ul1mol/LMgCl2和7.8ul2.5mol/LKCl，于室温下放置5min。 20.用Tris-tricineSDS-PAGE分析各个翻译反应的产物。 21.一旦显示的蛋白质已用SDS-PAGE观察到，优化反应体系的乙酸镁和氯化钾的浓度。逐渐从0.5～2mmol/L增加乙酸镁的浓度以及氯化钾的浓度从50～200mmol/L平行进行一系列的翻译反应。 22.如下在冰上制备1ml反应体系，最后加入网织红细胞裂解物： 80ul5umol/LmRNA显模板（最终为400nmol/L） 80ul12.5×不含甲硫氨酸的翻译混合物（最终为1×） 20ul8.6umol/L［35S］甲硫氨酸（最终为0.17umol/L） 2.5mol/LKCl（按照优化浓度） 0.5ul乙酸镁（按照优化浓度） 补水至600ul 400ul2.5×兔网织红细胞裂解物（最终为1X） 总体积1000ul 23.于30℃孵育1h，然后往上述各反应体系中加入65ul1mol/LMgCl2和235ul2.5mol/LKCl，于室温下放置5min。 注意事项 | 其他 | 1.材料 DNA库 2.试剂 1mol/LMgCl2 100mmol/L核苷三磷酸溶液 10×转录缓冲液 去离子超滤水 10U/ulT7RNA聚合酶 固体EDTA 尿素 0.5×TBE缓冲液 3mol/LNaCl 100％和70％乙醇 100mmol/LEDTA 末端为嘌呤霉素的DNA接头 100mmol/LATP T4多核苷酸激酶缓冲液 T4多核苷酸激酶 10×T4DNA连接酶缓冲液 10U/ulT4DNA连接酶 3mol/L乙酸钾溶液，pH5.3 兔网织红细胞裂解物翻译试剂盒（如RedNovaLysatekit，Novagen） 对照RNA 12.5×不含甲硫氨酸的翻译混合物 2.5mol/L氯化钾 25mmol/L乙酸镁 不含核酸酶的水 兔网织红细胞裂解物 35S甲硫氨酸 3.耗材 电洗脱仪（VWR或Schle1cherSchuelD） 变性PAGE 胶凝胶过滤柱（Pharmacia） |
