| 实验方法原理 | 用基于磁珠方法纯化CDNA和体外转录产物避免了纯化过程有机溶剂的使用和离心步骤。这个方案与基本方案中的纯化方法相当（步骤10～14或者步骤17～22）。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 待纯化样品：cDNA或体外转录的RNA 试剂、试剂盒 | 羧基端包埋的磁珠EDTA乙醇Trisacetate 仪器、耗材 | 磁力架（CPG） 实验步骤 | 1.实验前准备 1.1材料 待纯化样品：cDNA（见基本方案步骤11）或体外转录的RNA（见基本方案步骤19） 1.2试剂 羧基端包埋的磁珠（cDNA纯化：PerSeptiveBioSystem；体外转录纯化：BangsLaboratories） 0.5mol/LEDTA 3.5mol/LNaCl/20％（m/V）PEG8000（分子生物学级；无RNA酶） 70％（V/V）乙醇于无RNA酶的水 10mmol/LTrisacetate，pH7.8（无RNA酶） 1.3耗材 磁力架（CPG） 2.纯化cDNA： 2.1每150ulcDNA反应液取10ul磁珠（Perseptive），将所需磁珠放.入同一个微量离心管。 2.2把这个离心管放到磁力架上，让磁珠沉到一侧管壁。用枪小心地吸走上清。 2.3加入与起始磁珠体积相等的0.5mol/LEDTA，轻轻摇振重悬磁珠。再次把管子放到磁力架上，待磁珠分离后，吸去上清。再重复此洗涤步骤两次。 2.4用与起始磁珠体积相等的0.5mol/LEDTA重悬磁珠。 2.5每管cDNA加.入150ul3.5mol/LNaCl/20％PEG8000和10ul磁珠，轻轻摇振或涡旋混匀。室温下放置10min。 2.6把离心管放到磁力架上，让磁珠沉到一侧管壁（第一次约2min，洗涤时可以快点）。 2.7弃去上清，用150ul70％乙醇洗涤两次。最后一步尽量吸干乙醇，晾干2min。 2.8加入25ul10mmol/LTris-acetate（pH7.8），室温放置5min洗脱DNA。 2.9把离心管放到磁力架上，吸取并保存上清。 2.10通过PicoGreen的荧光测定cDNA的浓度。 3.纯化体外转录的RNA： 3.1每60ul体外转录反应液取20ul磁珠（BangsLaboratories），将所需体积磁珠放进同一个微量离心管。 3.2把这个离心管放到磁力架上，让磁珠沉到管壁一侧。用枪小心地吸走上清。 3.3加入与起始磁珠体积相等的0.5mol/LEDTA，轻轻摇振重悬磁珠。再次把管子放到磁力架上，待磁珠分离后，吸去上清。再重复此洗涤步骤两次。 3.4用与起始磁珠体积相等的2.25mol/LNaCl/10％PEG重悬磁珠。 3.5每管体外转录反应液加入60ul3.5mol/LNaCl/20％PEG8000和20ul磁珠，轻轻摇振或涡旋混匀。室温下放置10min。 3.6把离心管放到磁力架上，让磁珠沉到管壁一侧（第一次约2mim洗涤时可以快点）。 3.7弃去上清，用150ul70％乙醇洗涤两次。最后一步尽量吸干乙醇，晾干3min。 3.8加入25ul10mmol/LTris-acetate（pH7.8），室温放置5min洗脱RNA。 3.9把离心管放到磁力架上，吸取并保存上清。 3.10测定260nm的吸收值，定量RNA浓度。 注意事项 | 其他 | |
