【求助】PCR中的DNA聚合酶和载体的选择问题，希望大家帮忙

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2009-03-16

问题描述：

我要P一个3kb左右的目的基因，需要一个保真性高的酶，因为后面要测序，而且我的两个引物的GC含量相差也很大，还需要一个载体连接去进行筛选，这个载体要4kb以上的，因为要和我的目的基因大小相差大一点的，而且这个载体上还要有多个切割位点，好让我切割下来，与最终的质粒相连。
最近，我看了很多这方面的资料，但是我对这个方面不是很了解，所以现在搞得头昏眼花的，不知道该选什么酶和载体，希望大家多多帮忙
在此十分感谢

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jgc95

用户

用Pfu高保真酶扩增！载体选择PcDNA3.1

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无双蛛蛛

用户

谢谢，你的帮忙，我十分感谢，不过我稍微查了一下你说的载体，好像是5000多，我们老师不会给我买的，能给我推荐一个便宜一些的吗，300、500的，十分感谢，无限感激

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无双蛛蛛

用户

希望大家帮忙啊！！！我的平端载体应该选哪个啊

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fixdoph

用户

我们有top克隆平端载体，需要请联系我

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jk_xdx

用户

如果有条件最好用 PrimeSTAR GXL 如果没有那个条件可以用Prime STAR HS如果GC含量高可以用Prime STAR HS with GC buffer

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无双蛛蛛

用户

Prime STAR HS with GC buffer 真的很好用吗，我正在考虑呢

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jk_xdx

用户

如果从费用角度来考虑 LA taq with GC buffer 是非常好的。一般做5‘RACE我都用这个，LA Taq配GC buffer I 基本无敌，但是有的时候会有个别碱基错配。prime STAR的扩增效率能低一点，保真效果好，这个看实际情况决定。

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无双蛛蛛

用户

谢谢楼上的朋友，我的基因要去测序，要有保真性，呵呵，我想问问这prime STAR对于引物有没有要求啊，要求引物磷酸化吗??期待回来。。。。。。。。。。。。。。。。。。

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jk_xdx

用户

引物没有特殊要求，一般的PCR级别引物就可以。以下是说明书：http://www.takara.com.cn/explain/E/DR010A.pdfhttp://www.takara.com.cn/explain/E/DR044A.pdf需要注意的是这个酶是HS版本的，在PCR程序设定时最好在前面先加一步94度3分，这个说明书上没有提到，本人一般使用其中的2 step PCR反应条件。

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无双蛛蛛

用户

楼上的jk_xdx 十分感谢你的提醒，要不然我要走很多的弯路呢，好人好梦呵呵

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