核酸突变分析方法抉择:PCR、杂交、NGS?
| 实验材料 | DNA 试剂、试剂盒 | Trish·CldNTPMgCl2BSADTT 仪器、耗材 | 水浴锅 实验步骤 | 一、50μl反应体积： （1）50mmol/l Tris·Cl，pH8.0 （2）5mmol/l MgCl2 （3）5mmol/l DTT （4）100μmol/l 4dNTP混合液 （5）50μg/ml BSA （6）0.1U T4DNA聚合酶 （7）2μg DNA （8）11℃温育20min，加入2μl0.5mol/lEDTA或75℃加热10min以终止反应。 （9）反应体枳、4种dNTp的浓度、反应温度可依具体应用而变。 二、dNTp浓度的效应 1. 高浓度的dNTP在通常实验下可以增加聚合酶活性对外切酶活性的比值。 2. 在标记实验中，标记了dNTP的浓度降至1到2μmol/l，但标记dNTP不能低于1μmol/l 浓度，否则当dNTP耗竭时，会导致其外切酶活性对的降解。 三、度的效应 用T4DNA聚合酶标记3’末端时，反应温度保持在11℃，在较髙温度下，其外切酶活性易降解DNA模板。 其他 | 1. 放射性标记DNA片段的3’末端，含5’凸出端的DNA片段及浓度为1~2μmol/l的适当［α-32P］dNTP，在11℃温育20min。 2. 选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3’宋端，即所谓的“置换合成”。双链DNA片段在dNTP存在下与T4聚合酶温育，其3’末瑞的外切酶活性导致从3’末端降解DNA，当补加4种dNTP后，可激活其聚合酶活性，延伸DNA镆板的3’末端。在T4DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板时加入4种dNTP混合液，可获得最隹标记效果。 3. 变双链DNA的粘性末端成平端，便于平端克隆。在髙浓度4dNTP种存在下，酶促的降解终止于双链区，类似地，如果末端存在5‘凸出，酶将延伸凹进陷的3’端直至与5’端平齐。在实际应用中，DNA与T4DNA聚合酶和浓度各100μmol/ldNTP在温育20min。 |
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发布于 ： 2021-08-12
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