原标题：关于免疫治疗抗体设计和制造面临关键挑战的最新进展 摘要 治疗性抗体技术在生物制品市场占据着主导地位，在开发新的和改进的抗体治疗策略方面，该技术仍然能产生重要的产业利益。在过去的几十年里，许多重要进展推动了抗体开发的成功;然而，仍有进步的空间。考虑到人们对开发抗体疗法的兴趣，本文综述了在设计、生产和制备治疗性抗体时面临的一系列挑战和考虑，如稳定性、生物利用度和免疫参与。我们讨论了应对这些挑战的技术进步，重点介绍了一些已经临床应用的关键抗体形式。此外，我们还研究了新型制剂技术，如纳米载体给药系统对肺给药的潜在影响。最后，我们全面讨论了具有调节功能的抗体设计计算方法的发展。 1.引言 自1986年第一个治疗性单克隆抗体(mAb) Orthoclone OKT3 (Janssen Biotech, Horsham, PA, USA)被美国食品药品监督管理局(FDA)批准以来，抗体治疗已成为制药行业最具优势的生物治疗平台。迄今为止，治疗性抗体可治疗多种适应症，包括癌症、感染、自身免疫性疾病、心血管和神经系统疾病。目前抗体治疗被认为是最有前景的一类药物技术;它被不断应用于新发现的生物靶点，并以多种形式存在以产生战略性工程的下一代抗体疗法，被称为生物改良剂。国际免疫遗传学信息系统(IMGT, Montpellier, France)数据库显示，截至2018年12月，65个完整抗体和18个基于片段或重组融合抗体的治疗方案被批准用于临床试验，预计还有数百个临床试验将进入市场。 图1 截至2018年12月，通过(a)饼图和(b)表格显示的治疗性抗体形式所占比例 整体治疗性单克隆抗体目前是临床应用的主导抗体 (图1)，尽管近年来抗体工程技术已经取得了进展，可以生产高度优化的、战略性工程设计的更好生物疗法，同时生物相似性单克隆抗体也进入市场，与它们的原发者竞争。进一步的单抗形式包括抗体药物偶联物(ADC)、双特异性抗体、同型转换和糖基化。这些独特形式被战略性地设计以引入特殊的功能，可以结合双生物靶点，并调节Fc功能。单克隆抗体的片段如可结晶片段(Fc)、抗原结合片段(Fab)和单链可变片段(scFv)具有特异性结合生物靶点或免疫活化等关键功能。将这些片段分离出来，与其他单抗片段、生物功能蛋白、细胞毒性药物或药物载体融合，一直是开发下一代生物疗法的关键。图2展示了当前几个主要抗体形式，片段单克隆抗体、双特异性单克隆抗体、多特异性单克隆抗体和融合单克隆抗体。 图2 全单克隆抗体(mAb)、单克隆抗体片段和已用于治疗的主要融合单克隆抗体形式。蓝色椭圆形代表融合到单抗片段上的蛋白;然而，融合蛋白的大小和结构可能不同。片段包括可结晶片段(Fc)、抗原结合片段(Fab和F(ab)2)和单链变量片段(scFv)。此外，全单克隆抗体形式包括抗体偶联药物(ADC)、三功能抗体、双链可变区免疫球蛋白(DVD-Ig)和免疫球蛋白scFv融合(IgG-scFv)。多特异性片段形式包括双特异性F(ab)2、双特异性T细胞连接(BiTE)、双亲和定位分子 (DART)和串联双特异性抗体 (tandAb)。 2. 单克隆抗体生产的挑战和考虑 哺乳动物表达系统可以生产具有生物功能的单克隆抗体;然而，单克隆抗体片段和有简化(或缺乏)糖基化的重组融合单克隆抗体只适用于较低的生物表达平台。与化学合成的寡肽不同，单克隆抗体要大得多(单体140-160 kDa)，它由四个肽链(两个重链和两个轻链)通过二硫键和链间非共价相互作用结合在一起。此外，抗体在Fc (N297)的一个保守区域含有糖基化，促进了其稳定性和免疫反应。除了肽的合成，细胞还需要糖基化、折叠、定向和共价结合抗体肽链，以产生完整的、具有生物学功能的抗体产品。因此单克隆抗体不太可能通过化学合成和效率较低的生物表达系统如细菌，酵母，昆虫，植物细胞来生产，并且这些系统没有产生三级结构和糖基化的机制。事实上，许多与工业相关的菌株，如大肠杆菌，缺乏添加翻译后糖化的机制;酵母超甘露酸聚糖，引起免疫原性;昆虫细胞缺乏唾液酸化机制，产生免疫原性糖基。大肠杆菌等几个较低的生物表达系统不是很好的单克隆抗体分泌纯化平台，因为其表达水平低，并且不好的培养条件会促进产物降解。蛋白质在细胞内产生，包涵体和收获涉及到进一步的加工，如细胞裂解、包涵体回收、蛋白质增溶和复性，然后是进一步的下游纯化。尽管存在这些缺陷，但与哺乳动物表达系统相比，由于培养条件简化、培养基要求更低、生物生长速度更快、产品产量更高，因此开发低水平的生物表达系统具有较高的商业价值。 在考虑单抗的发现、制造、制剂和疾病治疗的整个过程中，出现了一些关键的挑战，这些挑战激发了人们对追求更好的单抗产品和治疗策略的极大兴趣。和所有生物治疗药物一样，单克隆抗体和基于单克隆抗体的疗法被限制于细胞表达系统，这一系统费用高且效率低，并且会因为表达系统和抗体本身结构出现不同的产物，需要下游进一步处理以去除杂质。尽管亲和层析已经在mAb纯化中运用的很成熟，但是在纯化的过程以及后续的病毒灭活过程中，mAb会限定在一定的PH和盐浓度下，导致mAb的不稳定性和降解。 影响单克隆抗体糖基化和电荷异质性的因素很多，影响着单克隆抗体的生物和药理特性。虽然本综述没有特别讨论，但改进和控制单克隆抗体生产技术解决了这些变化，以减少产品的异质性和靶细胞毒性。 正如所有生物疗法所面临的挑战一样，mAb和基于mAb的疗法目前仅限于冻干和液体制剂，用于静脉(IV)或皮下(SC)注射，以实现最大的生物利用度。蛋白质的自结合性和内在稳定性导致了这种限制，因为黏度和聚集倾向依赖于单抗浓度。制剂经过优化，在不影响配方中单抗质量的前提下，以最小的注射体积达到最高剂量浓度。黏度仍然是SC给药的关键限制因素，某些单抗疗法是合适的，而其他疗法则不是基于它们的溶解度、自关联和聚集特性。另一种非侵入性给药策略，如肺部给药会引起额外的机械压力，从而进一步导致单抗的不稳定性和丢失。此外，由于化学和酶的降解，以及在胃和肠道环境中吸收不良，口服给药不合适。 图3 简要概述了mAb疗法发展不同阶段的考虑事项 表1简要总结了mAb药物生产和制剂的主要挑战和考虑事项 3.单克隆抗体的发现和制造技术 传统的治疗性抗体发现技术要求免疫动物，主要将目标抗原免疫小鼠，产生混合B淋巴细胞进一步生产目标抗体。淋巴细胞将被分离出来产生单克隆杂交瘤细胞系，该细胞系分泌候选抗体，通过进一步筛选以分离抗体。这种方法产生非人类来源的高度特异性单克隆抗体文库，与完全人类单克隆抗体相比，这些单克隆抗体具有潜在的免疫原性，在诱导免疫应答方面也不那么敏感。通过将从非人类抗体中分离出来的可变结构域(嵌合)或互补决定区(CDR)残基(人源化)嫁接到人类抗体中，产生嵌合抗体和人源化抗体，从而解决了免疫原性问题。为了进一步提高转基因小鼠的人源化策略，将小鼠抗体重链和轻链基因替换为相应的人类基因;因此，他们表达了完全人类抗体。 噬菌体展示技术是抗体的主要筛选技术，它有效地促进了基因编码mAb抗体。用PCR方法将基因从B淋巴细胞中分离出来，然后将基因克隆到表达mAb的载体中，在噬菌体中表达载体文库，再用特定抗原筛选文库。文库会经过几轮筛选以分离出高亲和力的抗体，表达高亲和力抗体的基因会被筛选出来测序，设计抗体药和合适的表达平台。以PCR为基础的突变促进了大量的高亲和力文库的筛选。噬菌体表面展示技术促进了这些筛选技术，通过这个技术CDR区产生了糖基化位点。 在杂交瘤细胞中，mAb的表达，生产和质量可能会有很大差别。高产量的哺乳动物表达系统被开发出来以满足商业上高表达效率，高弹性，高质量和可重复性。特定抗体表达基因被插入到表达载体中，然后被转入到高效率的哺乳动物表达系统中表达分泌抗体；再通过亲和层析可以将抗体从细胞培养上清中分离出来。目前，主要用于商业免疫治疗抗体生产表达的细胞系有中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,小鼠骨髓瘤细胞（NS0）和小鼠杂交瘤细胞（Sp2/0）。然而,在研究和发展中,人类胚胎肾细胞系,如(HEK 293),羊膜细胞(CAP), HEK 293和淋巴瘤(HKB-11) 杂合细胞和胚胎视网膜细胞(PER.C6)中瞬时表达比CHO稳定表达更受欢迎，因为他们能快速生产大量的抗体以供初步研究。对生成的单克隆抗体文库进行相关体外测试，同时进行制剂稳定性筛选，以排除制造性较差的候选药物。有潜力最优单克隆抗体候选物将被高效、稳定的生产，促进治疗的发展。然而，从人类到仓鼠表达系统的一个缺点是糖基化谱的差异。CHO表达的单克隆抗体产生免疫原性非人Neu5Gc糖型，具有较高的唾液酸化，可能降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。因此，在开发早期阶段，需要在商业制造的表达系统中对先导物进行识别和表征，然后再进行工业规模化。在其他生物治疗药物中，经批准的单克隆抗体Fc融合治疗药物dulglutide (Trulicity, Eli Lilly, Indianapolis, USA)、efmoroctocog alpha和 eftrenonacog alpha (Eloctate和Alprolix, Biogen, Cambridge, MA, USA)，是在HEK293表达系统中产生的。然而，HEK293表达系统容易在培养物中诱导单克隆抗体聚集，这对细胞的生存能力是有害的，并在生产过程中造成产品的损失。因此，HKB-11和PER.C6是在人类细胞中表达mAb的首选商业人类细胞系。 已建立的用于片段或重组融合单抗治疗的较低生物表达系统包括大肠杆菌等细菌、酿酒酵母和巴斯塔利酵母、烟草、藻类等植物和蚕等昆虫。使用特别是大肠杆菌的表达平台被认为是高风险的，因为在单抗产品中存在潜在的内毒素污染，完全清除内毒素需要进一步净化步骤。然而,一些批准的mAb片段和重组抗体在大肠杆菌表达系统中生产, 包括certolizumab (Cimzia®, Celltech UCB, Brussels, Belgium), ranibizumab (Lucentis®, Genentech, San Francisco, CA, USA), 和 romiplostim (Nplate®, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)。与哺乳动物表达平台相比，大肠杆菌和P. pastoris 等较低的生物表达平台产量高、成本低，因此仍然是制造片段单克隆抗体的首选平台。 一种利用细菌和CHO细胞裂解物的新兴体外无细胞合成技术正在开发中，有可能减少生物副产物的形成，因为细胞裂解物可以完全表达引入的单克隆抗体蛋白。虽然这项技术目前并不适用于工业规模生产，但作为一种活细胞培养的替代品，它有很大的潜力。例如,不再需要特定培养基，反应可以连续，裂解物可以回收，线性DNA可以适用于表达系统(从而减轻多个克隆步骤),特定转录后修饰的酶可以被引入到系统中。尽管该技术在单克隆抗体制造方面具有明显的优势，但细胞裂解物与宿主细胞表达系统面临同样的挑战。也就是说，来自较低水平生物体裂解产物的单克隆抗体的翻译后修饰受到宿主生物体内源性机制的限制。此外，哺乳动物细胞裂解物的制备具有挑战性，而且这些裂解物的产量相当低。 目前的生物工艺工程和细胞系开发策略对提高单克隆抗体的可制造性至关重要。目前主要利用CHO细胞株表达mAb治疗抗体，这些CHO细胞株已被用于商业化生产，缺乏二氢叶酸还原酶或谷氨酰胺合成酶，通过对甲氨蝶呤和蛋氨酸磺酰亚胺抑制的耐药性来增强稳定性选择。哺乳动物细胞系已适应悬浮培养，它们在没有血清的培养基中可以支持更高的细胞密度和单抗滴度，支持大规模的补料批次，灌注系统，或连续培养系统。此外，为了增强代谢功能，不断地对细胞系进行工程设计，引入糖基化途径、提高分泌，增强对凋亡的抵抗以延长生存期，从而产生能够持续培养的高表达细胞系。 基因和表达载体的设计需要适应表达系统，以增加抗体的表达，通过密码子偏好增加细胞稳定性，提高转录，分泌，选择，整合的效率。载体有一个基因插入位点，以供抗体轻重链的插入，或者轻重链可以插入到双表达载体中。载体可以瞬时或稳定转染高密度的活细胞。在转染时可以调整抗体的轻重链以促进表达。在优化过程中可以引入绿色荧光蛋白观察转染效率。脂质体介导的转染优于所有其他哺乳动物转染策略，在培养前或培养过程中，脂质体通过DNA与阳离子脂质络合而发生化学诱导。尽管有更先进的试剂如Lipofectamine 2000和Freestyle MAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)， LyoVec (InvivoGen, San Diego, CA, USA)， FuGENE 6 (Promega, Madison, WI, USA) 和 TransIT-PRO®(Mirus, Madison, WI, USA),聚乙烯亚胺是最普遍使用的转染试剂，由于它价格低和有效性高。 单克隆抗体的商业化生产已经过渡到无血清、化学定义的、无动物的培养基，这消除了表达变异来源，特别是疯牛病驱动的。已经发现植物和酵母消化液(蛋白胨/水解物)、表面活性剂(如Pluronic F-68)、DNA甲基转移酶(偶氮替丁)和组蛋白去乙酰化酶(丁酸钠、丙戊酸)抑制剂等多种培养基补充剂可支持细胞活率和增强mAb表达。轻度低温培养也被证明可以减少细胞扩张，支持延长细胞生存能力，并提高单克隆抗体的表达。此外，在表达培养中不断补充尿苷、氯化锰和半乳糖证明了表达单核苷聚糖是成功的，其中mAb高半乳糖化以增强互补依赖的细胞毒性(CDC)活性。 补料批次生产、灌注和连续培养系统,培养基被不断加入到培养系统中 ,同时实时监控细胞活率,密度和代谢物水平,直到参数表明上层清液表达mAb的最佳收获时间。在灌注和连续培养系统中,细胞稀释速率在连续培养系统中保持等于或高于细胞增长率,它允许mAb连续表达,需要持续收获上层清液。上层清液的收获需要澄清技术,如使用沉淀剂/絮凝剂(如聚乙二醇,二乙胺乙基右旋糖酐,辛酸,聚乙烯亚胺),高离心力和过滤方法除去细胞和生物杂物,通过亲和层析捕获mAb。离心和过滤产生的机械力是不可避免的，尽管它们会通过破碎和聚集引起轻度mAb损失。 Protein A-结合为基础的亲和层析是目前最有效和应用最广泛的mAb捕获技术，基于它对各种人Fc的选择性和高亲和力，同时能在低PH时与mAb有效分离。mAbs片段和基于Fabs的重组形式，单链可变片段（scFv）不能用Protein A亲和层析来捕获，所以捕获蛋白G,M,L，离子交换层析，固定金属色谱法聚组氨酸捕获的选择性替代方案被发展出来，可以与不同mAb片段结合。生产中亲和层析的一个优势是，在进一步纯化之前mAb会经低PH清洗已灭活病毒；但是这会使mAb产物在低pH高浓度环境下，导致mAb不稳定性、聚集和酸性变体的形成。 mAb的捕获，后续需要进一步去除一些杂质，例如宿主细胞蛋白和DNA,浸出的亲和层析配体，降解的mAb产物如片段，聚集物和酸性变体。会根据蛋白的独特特性例如等电点和分子质量来选择纯化方法，例如阴离子阳离子交换，疏水作用，体积排阻法。亲和层析步骤不可避免的会使mAb产物处于高离子浓度和高浓度下，导致mAb轻度不稳定与聚集。后续纯化步骤，mAb经历病毒灭活步骤，例如过滤，溶液交换，浓缩，透析过滤以产生大量mAb。 4. 制剂生产策略和考虑 与所有生物疗法一样，改善单克隆抗体和以单克隆抗体为基础的治疗方案的策略和考虑仍然是一个持续的挑战。首先，整个单克隆抗体不适合口服、鼻腔或肺部给药，因为它们容易在胃肠道中被化学和酶降解。通过这些途径获得的单克隆抗体的生物利用度较差，这是由于单克隆抗体的极性表面电荷和相对较大的分子量，限制了其在粘膜中的转运。 片段单抗平台，连同辅药和聚乙二醇化技术，已被开发以避免特别是肺部给药的局限性。然而，身体的这种反应对mAb的稳定性是进一步的挑战，导致抗体的降解和功能的丢失。一些生物药已经被成功应用于肺部给药，例如吸入型胰岛素Afrezza® (MannKind, Westlake Village, CA, USA),目前一种促红细胞生辰素-Fc融合蛋白和一种纳米体靶向呼吸道合胞体病毒正在进行临床试验，显示进一步发展这种基于mab的疗法全身或局部给药是有希望的。 微胶囊化、脂质体化、纳米颗粒化等药物载体技术的应用，从本质上提高了单克隆抗体的稳定性，控制了单克隆抗体的释放，延长了其半衰期。这些纳米载体的配方策略引起了人们的极大兴趣，因为它们有望开发出更小侵入性的吸入配方，并且比目前已有的配方具有更好的效果。 目前大多数批准的mAb疗法都是静脉注射,尽管基于商业利益开发了一些mAb，主要是SC全身性给药，还有一些玻璃体和肌肉注射制剂主要用于局部组织给药。其中，抗HER2抗体曲妥珠单抗最初被开发为静脉注射剂型，并成功转化为SC剂型，而下一代治疗方法则直接转向SC剂型，如抗TNF-a抗体adalimumab。注射给药优于静脉给药，特别是在慢性疾病的治疗方面，减少了卫生服务的负担、病人的耐受性和坚持治疗;然而，单克隆抗体固有的理化性质可能不适合注射剂型。考虑到单克隆抗体的体积小、注射压力和注射用的高( 100 mg)有效剂量，单克隆抗体的粘度和聚集倾向成为需要解决的关键挑战，因为它们依赖于单克隆抗体的浓度。某些单抗疗法是合适的，而其他疗法则不是基于它们的溶解度、粘度、自缔合、固有稳定性、聚集和沉淀特性。 可注射的单抗制剂可以进一步改进，使用辅料来增加溶解度，降低粘度，增强单克隆抗体的稳定性。辅料根据其理化性质、药代动力学和安全性来考虑配方。例如，聚吸附剂常用于生物制品中作为稳定剂;然而，它们在高浓度下的加入会使蛋白质变性，并引起注射部位反应等副作用。静脉注射抗体药物通常制成粉末，用时进一步稀释，可注射制剂通常制成液体。液体状态的mAb更容易生物降解，和粉末状态相比更不稳定，有更短的半衰期。然而，生产粉末的过程会使mAb收到一定物理破外，导致不稳定和降解，减弱了抗体的功效。 在加速聚合研究中，作为产生mAb文库初步筛选过程的一部分，阐明了长期稳定性预测。单克隆抗体的稳定性很大程度上取决于其可变区域CDRs中的氨基酸组成、结构和潜在的糖基化。溶解度降低或聚集倾向增加的原因必须与单抗和生物靶标之间的分子相互作用一起考虑。已经开发出计算工具来阐明mAb CDR结构中具有高聚集倾向的氨基酸，并且已经开发出通过直接氨基酸替换和添加糖基化位点的战略来改善溶解度和聚集特性的策略。mAb稳定性和目标作用优化被认为是初步药物发现的基础步骤，因为mAb治疗药物的开发、制造和配方的适用性取决于单克隆抗体的稳定性。 5. 提高单克隆抗体癌症治疗的组织穿透能力 抗体治疗目前局限于非肠道给药途径，以获得最大的生物利用度和全身分布，然而把药物运送到特定的目标组织，如肿瘤治疗，仍然是一个挑战。由于单链抗体的极性表面电荷和相对较大的分子量，限制其穿透生理屏障，因此从血管到组织的穿透性很差。这种穿透效率进一步被全身和局部的mAb清除效率影响。通过一些突变技术增强了mAb和生物体的亲和性和穿透效率。然而，对于肿瘤组织而言，穿透力受到肿瘤结合位点屏障的限制，在肿瘤周围表达的抗原捕获了向周围组织中的大部分mAbs，抗原过表达放大了这一反应。低于1nM的mAb亲和性表明肿瘤没有进一步扩散，组织渗透和聚集。mAbs和生物体之间的亲和力增加mAbs的吸收，内化和代谢，进一步导致ADCC和mAb的清除效率。 片段单克隆抗体平台比全单克隆抗体治疗显示出更好的组织穿透和生物分布;然而，缺乏Fc区域小肽的缺陷是体内半衰期和保留时间缩短。提高单抗片段半衰期的技术主要是通过peg修饰，以及策略性Fc突变和糖基化来加强Fc受体(FcRn)的循环。此外，高糖基化技术已成功地应用于其他生物治疗，如糖基化促红细胞生成素Aranesp (Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)。相反，与整个单克隆抗体相比，纳米载体平台相对较大，表现出了优越的药代动力学和肿瘤保留，以及前面提到的增强稳定性和单克隆抗体的持续、可控释放。这些增强的特性引起了人们对开发mAb -纳米颗粒平台的极大兴趣，以便更好地穿透肿瘤，并实现靶向和持续的治疗性药物传递。除了纳米载体外，为控制单克隆抗体的释放而开发的其他制剂还包括水凝胶和晶体抗体，它们已被证明是开发中稳定的、可注射的制剂。 此外，为了进一步提高其他生物治疗药物的稳定性和半衰期，重组技术将其与mAb Fc融合，引入FcRn循环作为保护机制，创新性地扩大了基于mAb的治疗平台的适用性。值得注意的例子包括TNF受体Fc融合蛋白Enbrel (Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)，作为自身免疫性疾病中TNF-过表达的抑制剂，Factor IX Fc融合蛋白Alprolix (Biogen, Cambridge, MA, USA)，是血友病患者的血液因子补充物。 6. mAb免疫应答功能的战略性调整 通过同型转换、糖蛋白工程和突变等手段来调控单克隆抗体的免疫功能，已被证明有利于开发更有效的单克隆抗体治疗策略。与Cq1结合的抗体促进补体级联、FcR1A/B, FcR2A和FcR3A/B受体激活免疫应答功能;Fc R2B平衡效应反应，FcRn延长mAb半衰期。与这些受体的结合主要通过结合C铰链区、CH2和Fc中保守的糖基化区域(N297)。 IgG3不能有效地与FcRn结合，这使其半衰期缩短到大约7天，而其他IgG亚型的半衰期为21天。在大多数单抗设计的情况下，延长半衰期是首选的，以延长血清中单抗的有效剂量。与IgG1相比，IgG2和IgG4单克隆抗体的效应功能较弱，因此，在某些情况下，为了增加单克隆抗体的安全性(例如，通过ADCs降低脱靶细胞毒性)，需要对免疫系统进行最小程度的干预。Eculizumab (Soliris, Alexion Pharmaceuticals, New Haven, CT, USA)是第一个(也是迄今为止唯一一个)被批准的重组IgG_ 2(CH1/Chinge)–4(CH2/CH3)混合单抗。进一步的跨亚类变异型单抗治疗正在开发中，从IgG2和IgG4亚类引入关键的氨基酸取代物来有意抑制受体功能。通过氨基酸取代N297或T299 (aglycosylation)来去除保守的糖基化位点也显示出效应功能下降;然而，这是以牺牲单抗稳定性为代价的，因此不适合整个单抗治疗。 另一方面，增强ADCC和CDC有助于免疫系统在没有结合细胞毒性药物的情况下参与肿瘤组织。某些糖修饰Fc保守的糖基化区域，如核心岩藻糖缺失(岩藻糖基化)和半乳糖过化，已经证明增强了mAb与FcR3A 和 Cq1的结合，特别是增强了ADCC和CDC等。岩藻糖基化mAb benralizumab Fasenra., AstraZeneca,London, UK) 和mogamulizumab (Poteligeo®, Kyowa Hakko Kirin, Tokyo, Japan), 以及低海藻糖mAb obinutuzumab (Gazyva®, Genentech, San Francisco, CA, USA)，使目前批准的一些疗法,以及其他几个在研究中的(临床试验),表明通过加强ADCC改善mAb疗法这项技术的商业利益和适用性。然而，调控唾液酸化作用在单抗治疗中的意义是一个有争议的话题，有几份报告显示ADCC和CDC效应的降低，其他报告没有明显的差异。这突出了明确定义此类操作的体内反应能力的必要性。 目前批准的单抗疗法中，没有一种含有氨基酸取代物通过调节FcRn的结合特性来改善半衰期，通过结合互补因子Cq1来改善CDC，或者通过增加与FcR1A 和 3A的结合亲和性改善ADCC。然而，已经被报道了一些突变可以改善单克隆抗体疗法，申请了专利并在临床进一步发展应用，表明了这项技术的商业利益。为了更全面地理解mAb一些改造策略来调控免疫应答，请阅读以下综述。 7. 单克隆抗体聚合预测和合理设计的计算方法 在对单抗肽序列、结构、构象及其相关的生物相互作用的分析进展，已经成为各种以表征、设计和基于mAb的优化治疗的计算工具发展一个重要组成部分。mAb结构数据的持续追求导致了几个集成数据库的发展，尤其是IMGT，作为数据挖掘的关键资源。分子动力学(MD)模拟分析推动了mAb分子内部相关分子相互作用的发现和表征的计算分析，mAb与生物靶标结合，mAb与周围环境的表面关联。这些相互作用可以推断单抗的内在稳定性、目标结合、溶解度和聚集倾向。MD模拟和来自晶体结构的自由能计算仍然是高度特异性阐明mab -靶分子间相互作用与结合亲和性的关键，因为可以预测诸如氢键形成等重要相互作用并确定分子关联的强度。然而，计算建模和模拟工具同时分析mAb结构和表面极性可以预测mAb关联性、溶解度和聚集倾向。值得注意的是，AGGRESCAN3D、TANGO和spaghetti是预测单克隆抗体位点特异性聚集倾向的最主要工具。 通过实验推导，初步阐明了作为氨基酸序列和高阶结构(HOS)的单晶结构，从而建立了单晶结构的固态三维模型。质谱技术已经成熟，可以产生高通量和正交分析来阐明mAb肽序列、氧化、脱酰胺化和糖基化的异质性，以及最近的天然的、不稳定的和聚集的HOS。x射线晶体学技术已经成为阐明单克隆抗体晶体结构的基础工作。由于单克隆抗体HOS的复杂性和单克隆抗体构象的异质性，生产单克隆抗体具有一定的挑战性。然而，近年来一些技术已经发展到可以确定单边结构和相互作用，包括圆二色性(CD)、红外(IR)和拉曼光谱、低温电子显微镜和核磁共振(NMR)光谱。在现有的HOS技术中，2D-NMR和x射线晶体学(其次是MS)提供了最高的灵敏度和局部特异性。相比之下，CD、IR和raman是高通量方法，尽管它们的敏感性要低得多。 到目前为止，只有4个完整的IgG抗体具有成功测定的晶体结构(PDB ID: 1HZH, 1IGT, 1IGY，和5DK3)。只有1HZH是完全的人IgG1，5DK3 是人源的IgG4/k，两者都是MD模拟的结构模型。然而，片段单克隆抗体在生成晶体结构方面取得了更高的成功，这使得在生成单克隆抗体片段和为数据挖掘和肿瘤分析获取复杂的晶体结构库方面有了更大的追求和贡献。 在获得候选单克隆抗体的相关晶体结构后，详细的晶体结构和MD模拟分析被广泛用于阐明单克隆抗体的分子内相互作用，其内在稳定性，以及分子间相互作用，生物靶标相互作用和自连性。分析了特定的结合位点，其他氨基酸替代这个位点之后会破坏分子间结合，找到其他潜在结合位点。然后对天然和改造mAb结构进行MD模拟，以阐明任何相关的键形成、相互作用，以及改造抗体产生的更有利的结合自由能，其中有希望的候选者可以通过体外分析合成和验证。这一预测方法已成功地应用于单克隆抗体突变的识别，以调节受体功能、结合靶标、优化捕获等，最近，从感兴趣的靶点设计新的抗体。己经确认了一些影响功能的突变，例如为获得更强的ADCC和CDC作用，设计突变点增强与Fc R2A, Fc R3A, Cq1的识别结合,减少和Fc R2B的结合,增加与FcRn的结合可以延长半衰期, 为减少ADCC和CDC作用可以减少与Fc Rs和Cq1 的结合,这些特点对于mAb亚型都是适用的。此外，糖化单抗变体与FcRs的分子相互作用已经通过模拟得到了确认，从而证实了观察到的效应。 通过计算模型工具进一步评估了抗体自结合性、溶解度和聚集倾向，这些计算模型工具描述单克隆抗体的结构和表面极性，同时分析单克隆抗体结构中氨基酸的局部空间排列、溶剂可及性和局部表面电荷。特别是，表面暴露的疏水性被认为是蛋白质聚集倾向的主导机制，其中识别了mAb结构中的聚集倾向区域(APRs)。将已识别的APRs替换为gatekeeper（极性）极性氨基酸具有抗聚集性，并能改善溶解度，验证了该策略对提高单克隆抗体稳定性的有效性。大多数APRs都位于与生物相关的mAb区域，即CDRs和Fc。通过基因突变靶向这些APRs可能会破坏重要的生物学功能和mAb结构。分析单克隆抗体的分子间相互作用对于分析氨基酸替代后对单克隆抗体的内在稳定性影响是必要的;如果构象发生变化，那么生物活性就可能被破坏。有趣的是，增强生物功能的突变一定程度上降低了单克隆抗体的溶解度和稳定性，进一步表明单克隆抗体的内部结合特性与其生物活性有关。 除了mAb结构中的残基替换外，其他报道的干扰APRs反应的策略包括同型交换和添加N连接聚糖。此外，单克隆抗体的CDR区域有N -连接糖基化，比同样CDR区域没有糖基化的mAb具有更好的溶解性和稳定性，并且不影响他们的极性，尽管这一现象并不常见。选择N -连接糖基化位点的原则是在空间上与APRs明显接近位点，引入的糖链在空间上阻止了APRs的自连。通过添加糖基来延长单克隆抗体的半衰期的好处，正如高糖基化的生物疗法(以及通过改进制剂策略来提高单克隆抗体的溶解度和稳定性)还有待实现，表明这是一种非常有趣且有重大意义的技术。 8. 结语 治疗性抗体已经并将继续成为生物制药行业的关键和主导技术。抗体多种设计形式可以让其参与特定治疗,包括ADCs作为靶向药物全身给药、双特异性和片段mAb的参与，提高生物利用度,和Fc重组延长半衰期，参与免疫反应。进一步的进展包括通过Fc的操作来调节Fc的受体功能，包括通过同型转换、糖基化或Fc区域的突变，以及片段单克隆抗体的PEG化以提高半衰期。发现、制造和制剂技术的进步进一步推动了治疗性抗体的成功，特别是表达系统的发展和从静脉注射到皮下注射的转变。基于人的表达系统已广泛应用于单克隆抗体的开发，并成为公认的单克隆抗体治疗的制造平台。此外，无细胞合成技术有潜力在制造过程中有提高效率。 尽管新一代抗体治疗技术的发展使治疗效果得到了很大的改善，但制造过程和制剂的许多发展挑战都是需要考虑的。基于通过口服、鼻腔或肺部途径容易受到化学和酶的降解，因此目前抗体治疗仅限制静脉或皮下注射。尽管通过静脉注射/皮下注射获得了最大的生物利用度，但基于mAb的治疗方法组织穿透性较差，这限制了它们的局部生物利用度，需要高药物浓度才能达到有效剂量。稳定性是以mAb为基础的治疗需要考虑的一个显著和反复出现的挑战，它影响了产量和制剂。一些以提高单克隆抗体稳定性的策略正在开发中，以便潜在地生产用于肺部或口服制剂。值得注意的是，计算工具已经成熟，可以预测抗体结构和聚集。通过这些方法，在区域内通过合理的突变和糖基化改善mAb的稳定性和聚集倾向，并且这可以应用于同一亚型内的所有mAb。此外，纳米载体技术已被证明可以增强稳定性和潜在地控制单克隆抗体的释放。合理的单抗设计和纳米载体技术的改进有可能克服这些挑战，开发出更好的治疗策略，并最终制定出非侵入性给药途径，如肺部给药。 原文来源： Sifniotis V, Cruz E, Eroglu B, Kayser V. Current Advancements in Addressing Key Challenges of Therapeutic Antibody Design, Manufacture, and Formulation.Antibodies (Basel). 2019 Jun 3;8(2). pii: E36. 版 权 声 明 版权为生物制品圈所有。欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载或引用本网版权所有内容须获得授权且在醒目位置处注明“转自：生物制品圈”。返回搜狐，查看更多 责任编辑：