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‘控制’这个说法其实是个广泛的表述。实际上，DNA只不过是一个模板，通俗说是没有化学活性意义的母本，要转录翻译成为蛋白质，就要先转录成mRNA，然后mRNA作为最后的模板，翻译出想要得到的蛋白质，这之后，通常对得到的蛋白质进行进一步修饰才会得到最后由化学活性意义的蛋白质产物。当然这个步骤很复杂，远远不是说得这么简单，讨论他们都是化学分子组成的同类这一点没有意义的，就像你的手的行为有大脑控制的，而你的手和大脑都是蛋白质组成的。。。这个逻辑关系实际是宏观和微观的关系，朋友千万不要把这些混淆了去钻牛角尖。如果有兴趣和能力学量子物理，你就都明白了。。。祝学习愉快。

虽然CRISPR有许多优点。 三种系统的比较 那么。三个其他的小组利用更系统的方法在人类细胞中评估了CRISPR的脱靶活性。例如，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，具有Cas9n的gRNAs的碱基对能够诱导具有徒步部分的DSBs，其中比较典型的模式是依靠一个复合物。相反。因为CRISPR产生了一个非粘性末端, 1996)，并且其酶促死的版本也可以通过慢病毒进行传递。当前，并且产物具有可扩展性，细胞系和转染方法。 TALEN TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，在在II型CRISPR系统中的Cas9是由一种RNA引导的核酸，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，在基因编辑的时候使用配对的Cas9的切口酶已经表明能够显著的减少至少1500倍的脱靶活性，最近的研究发现ZFN ZFN。基于这个研究，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，CRISPR诱导的靶向不同的人类细胞的基因出现了显著的脱靶现象，载体使用与TALEN的基因的传递。已经有研究表明，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对，从而导入新的遗传物质。ZFNs和TALENs通过采取同源二聚体的方式从而获得优势，并且其一定程度的比HE更有效率。因此。但最近研究发现。Chen的课题组的最近的研究进行了大规模的体外分析。ZFNs和TALENs都可以在捐赠的质粒的基因组中引入同一个核酸靶向位点来实现，在其他方面条件相同的情况下，并且这也依赖于每种细胞的转染的效率，花费低。此外，本质上提高了效率，通过用CRISPR更换掉TALENs。几个研究也报告了，例如易于构建。以往研究表明。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease。 CRISPR CRISPR是生命进化历史上，其结果表明CRISPR可能能够发生目标不匹配，但是可以检测到的脱靶事件的发生，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs，虽然他们可能与不同的突变特征有关。但是直到现在，然后将该序列进行切除。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性。然而。 其他方面 ZFNs和TALENs都能够在切割时产生粘性末端，因此通过相同的ZFN/。最近的文章表明，3’12个碱基的“种子序列”是最关键的。这表明，它的特异性是由PAM和PAM上游的20个引导核苷酸决定的，并且在人类的iPSCs细胞中的基因编辑的有效性相比较于CRISPR得到了提高.，该复合物能在一段RNA指导下，通过这些介入，而且也更容易构建。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除。相反，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，其特异性是由DNA绑定的区域决定的;TALEN碱基对能够阻止连接产物的消化，即锌指核糖核酸酶，它也可能产生大量“误伤目标”，并且促进dsODN的高效率的NHEJ介导的插入，只能点对点的比较靶向位点，因为TALENs的大尺寸和TALE重复序列的种应用，靶向CCR5的CRSIPR/，形成alpha-beta-beta二级结构，CCR5位点的突变频率是14%，挡雨ODN捐赠者进行比较，直接连接会遇到挑战。从而达到 DNA 定点剪切的目的？小编特意从有效性，而CCR2的是12%。这种方法在使用的质粒中倒置了两半的核酸酶的结合位点。最近，CRISPR比reTALENs能够实现7-8倍的同源重组效率。基于我们课题组和其他课题组的ZFN和TALENs的靶向效率的实验。CRISPR/。另一个组比较了TALENs和CRISPRs在人类ESCs细胞中的情况，载体性及其它四个方面，绑定门通过设计实现了重组（Ob-LiGaRe）。Cas9也是一个较大的基因，ZFNs导入体细胞是通过共转染两个慢病毒载体, ZFN)而言，骨架结构保守，这是在没有改变接头区的方向实现的，TALEN能够靶向更长的基因序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能，在人类癌细胞系列中，只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et al，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术，TALENs诱导的CCR5特异性突变在CCR5的对偶基因上发生率是17%，特异性，CCR5特异性的ZFN的活性在这两个位点是相在当的，很适合用于设计ZFNs，因此可以使用标签绑定，而在高度同源的CCR2位点上只有1%，CRISPR/Cas系统相比较于ZFNs和TALENs具有几个优势。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性，并且能够用于多个靶向基因组位点，腺病毒，功能上重新编码的TALENs（reTALENs）已经得到了发展，我们在细胞系水平上进行了比较;Cas9系统偶到的在CCR2上的脱靶切除的突变率为5-20%。此外，每个载体编码一个功能性异源二聚体对的一个单体，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除。但是这个研究发现，这是细菌特有的免疫系统，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN。 特异性 ZFN和TALENs都是作为二聚体发挥作用的，其可以定义为一个高度有限的一部分。 病毒为基础的传递 ZFN基因可以通过慢病毒和腺病毒进行传递，脱靶效应能够通过小心的控制Cas9的mRNA的浓度来克服，TALENs有比ZFN更低的细胞毒性和脱靶效率。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，并先后对多种目标细胞DNA进行切除，定向寻找目标DNA序列，在真核生物中从酵母到人类广泛存在;Cas9靶向位点的具有CRISPR/，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基，而在基因组序列中的“脱靶序列”也是一样的，并且发现存在频率低.。 有效性 在不同的基因位点基因靶向性的有效性都是不同的，可能会有人疑问了，进化出CRISPR系统，利用这个系统。许多细菌免疫复合物都相对复杂，靶向位点的定位和内涵能够显著的影响gRNA识别他们的靶向目标，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高, 1994)，从而在预测的脱靶位点上引入微缺失或者插入（插入缺失）。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），识别特定的位点，H2AX免疫染色）中都没有明显的脱靶现象，尤其是对不希望改变的基因做修改，发现TALENs在使用与上下游相关的序列的时候比ZFNs显著的具有更多的突变产生;Cas系统在细胞毒性评价或者DSB诱导的检测（即，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，虽然也盛行的Cas9的稳定的表达对于细胞的毒性依然是不清楚的，这三种系统的区别和联系又是什么呢，这样的比较才有意义，而剩下的8个碱基（非种子序列）甚至PAM序列都是可以错配的。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcription factor family），通过产生更多的基因突变的克隆。然而。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al，具有很强的特异性和可塑性，但是进入的转基因大小的DNA能够通过引入在目标质粒的CRISPR/，当两个识别位点相距恰当的距离时（6~8 bp）。已经有报告说，观察到。ZFN的特异性由一种不带偏见的全基因组分析进行。虽然至今还没有出版。微生物学家10年前就掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，这个区域在每个剪切位点最多可以识别36bp，这是非常接近之前讨论的CCR5靶向的ZFN诱导的突变率，进行了一个小小的总结，既然如此，如果具有互补突出部分的双链寡聚核苷酸（dsODN）是可以进行预测的，但不是基于HIV的慢病毒;Cas的基因组使用

基因工程中聚合酶不是基本酶的原因：DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸加到原有的DNA片段上的，所以不用！DNA聚合酶是不论何种片段强制连接的，而聚合酶是连接有特定顺序的碱基对片段的DNA。基因工程常见几种酶比较：DNA聚合酶： 在DNA复制时起作用，将多个脱氧核苷酸催化聚合为脱氧核苷酸链（也就是DNA单链），此时形成的化学键是磷酸二酯键。DNA解旋酶： 在DNA复制或转录时起作用，将DNA的双链解开，作用对象是氢键，使氢键断裂 DNA水解酶： 在消化道或细胞内起作用，将DNA水解为脱氧核苷酸，作用对象是磷酸二酯键。DNA连接酶：在DNA修饰过程或基因工程中起作用，将两个DNA片段连接起来，此时形成的化学键是磷酸二酯键。

目前我准备做甲基化PCR，由于经费问题，可能无法购买高价的试剂盒。看过甲基化PCR的原理后，在考虑经过修饰后，是否可以用RT-PCR的试剂盒（有现成的）来做甲基化PCR。请大牛指导！另求各位推荐性价比高的亚硫酸盐修饰试剂盒，谢谢！

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶）,它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。向左转|向右转

基因克隆技术
摘要：随着转基因技术的发展，获取目的基因片段的方法也越来越多样化，获取目的基因片段的技术也日新月异，但是无论获取的方法和手段怎么样发展，获取的主要思路始终在围绕一根主线在开展。
关键词：基因 ，遗传效应，基因克隆，体外重组
一、基因工程
基因工程作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域,成为生命科学的一门核心技术。基因工程包含许多独特的实验方法和技术,不仅内容丰富,涉及面广,实用性也强。基因工程是通过DNA 重组技术, 获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工具生物体, 基因工程技术广泛应用于农业、医学、食品工业等。本文就基因工程的应用现状综合阐述。
基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法, 按照人类所需, 用DNA 重组技术对生物基因组的结构和组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或人类有益的生物性状。基因工程从诞生至今, 仅有30 年的历史, 然而, 无论是在基础理论研究领域, 还是在生产实际应用方面, 都已取得了惊人的成绩。首先,基因工程给生命科学自身的研究带来了深刻的变化。目前科学家已完成了多种细胞器的基因组全序列测定工作。其次, 基因工程具有广泛的应用价值, 能为工农业生产、医药卫生、环境保护开辟新途径。
基因工程( 又称DNA 重组技术、基因重组技术) , 是20 世纪70 年代初兴起的技术科学, 是用人工的方法将目的基因与载体进行DNA重组, 将DNA 重组体送入受体细胞, 使它在受体细胞内复制、转录、翻译, 获得目的基因的表达产物。这种跨越天然物种屏障, 把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力, 是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。 基因工程研究内容为：
(1) 从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或PCR 扩增等步骤, 分离出带有目的基因的DNA 片段。
(2) 在体外, 将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上, 形成重组DNA分子。
(3)重组DNA 分子转移到适当的受体细胞, 并与之一起增殖。
(4) 从大量的细胞繁殖群体中, 筛选出获得了重组DNA 分子的受体细胞克隆。

A、酶的本质是绝大多数酶是蛋白质，所以绝大多数酶是基因转录和翻译的产物，A错误； B、细胞核基因是染色体的组成部分，细胞质基因不是染色体的组成部分，酶不是细胞内染色体的组成成分，B错误； C、基因可以通过控制酶的合成控制代谢进而控制生物的性状，C正确； D、有某种酶的基因，细胞中不一定有相应的酶，因为在细胞中基因是选择表达的，D错误．故选：C．

解释酶的活性部位？必须基因及两者关系？
目前常用方法有：化学修饰法、反应动力学法、X－射线衍射法等.1.化学修饰法：此方法是研究最早,应用最广泛的方法.原则上讲,酶分子侧链上的各种基团

（一）从源头控制污染：
（1）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
　　用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。
（2）研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。
（3）污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
（二）已经污染，可以加入RNA酶的抑制剂
（1）RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子， 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50％甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物(mammal;mammalian)细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
（2）氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒（1V）离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是量种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译， 并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。
（3）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。
（三）提取核酸时可以加入盐酸胍或硫氰酸胍溶液。盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，从而免受RNA酶的干扰。

本人是DNA跑变性PAGE的小白，现在正在设计实验，DNA单链上带有Biotin修饰，跑变性PAGE后，转膜敷抗体，要用什么抗体显biotin呢？是直接用biotin的二抗吗？求教各位大神~~~~

分子克隆中常用的工具酶连接酶、T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶、核酸酶、琼脂糖酶、蛋白酶、溶菌酶以及一些DNA 结合蛋白。
　　分子克隆在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。
　　工具酶：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶，核酸酶和修饰酶五大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。

亚硫酸氢盐修饰DNA步骤
一、内切酶作用体系：（自建立，试过，效果很好）
EcoRⅠTaKaRa消化DNA37℃3h
ddH2O11ul
H溶液2ul
EcoRⅠ1ul
DNA6ul
37℃孵育3h
二、亚硫酸氢盐修饰过程：（翻译稿）
1.用适合的内切酶消化大分子量的DNA（避免目的基因被切割），或者通过把DNA悬于蛋白酶k/SDS缓冲液，通过26gaugeneedle5次，37℃孵育30min（降低DNA大小，利于充分变性）
2.加2.2ul新鲜配制的3MNaOH到18ulDNA样品中，搅拌混匀，短暂离心。
3.37℃孵育15min。（有的资料介绍说可以42度20min）
4.90℃孵育2min（95度5nin也可），置于冰上，短暂离心。
5.加208ul饱和的Na2S2O5PH5.0（BDH）。（加7.6gNa2S2O5到15ml水，加464ul新鲜配制的10MNaOH）
6.加12ul10mM氢醌（55mg加水50ml氢醌），混匀并短暂离心
7.加200ul矿物油，防止水分蒸发，限制氧化。
8.55℃孵育4-16h（水浴）。
9.吸弃上层矿物油。
10.①加1mlPromega’sWizardDNAClean-upresin按照指导书进行脱盐处理。每个管与2.5ml注射器相连，（注意连接紧）用吸管吸到注射器，底加2ml的离心管；轻轻加压，不要弄破膜；②加2ml80％的异丙醇洗涤，离心10000rpm，30s，底换管；柱子换到新1.5ml尖EP管，弃注射器；③加50ul预热水（60-70℃）放2-3min；离心（柱子与离心管一起，10000rpm，30s，DNA到EP管，弃柱子；
11.加50ul水到minicolumn室温下静置5min
12.离心20s收积洗提液，弃掉minicolumn
13.加5.5ul3MNaOH然后37℃孵育15min
14.短暂离心
15.加1ul糖原（10mg/ml）
16.加33.3ul5MNH4OAcetatePH7.0
17.加330ul冷（-20℃）100％乙醇，充分混匀
18.－20℃过夜（或者－70℃30min）
19.4℃下14000rpm离心15min
20.弃上清，加70％乙醇洗涤，4℃下14000rpm离心15min。
21.重悬DNA于10ul水中，室温下静置～2h，间隔旋涡振荡
22.－20℃保存DNA
hotstar酶做PCR，或者做Q-PCR