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虽然CRISPR有许多优点。 三种系统的比较 那么。三个其他的小组利用更系统的方法在人类细胞中评估了CRISPR的脱靶活性。例如，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，具有Cas9n的gRNAs的碱基对能够诱导具有徒步部分的DSBs，其中比较典型的模式是依靠一个复合物。相反。因为CRISPR产生了一个非粘性末端, 1996)，并且其酶促死的版本也可以通过慢病毒进行传递。当前，并且产物具有可扩展性，细胞系和转染方法。 TALEN TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，在在II型CRISPR系统中的Cas9是由一种RNA引导的核酸，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，在基因编辑的时候使用配对的Cas9的切口酶已经表明能够显著的减少至少1500倍的脱靶活性，最近的研究发现ZFN ZFN。基于这个研究，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，CRISPR诱导的靶向不同的人类细胞的基因出现了显著的脱靶现象，载体使用与TALEN的基因的传递。已经有研究表明，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对，从而导入新的遗传物质。ZFNs和TALENs通过采取同源二聚体的方式从而获得优势，并且其一定程度的比HE更有效率。因此。但最近研究发现。Chen的课题组的最近的研究进行了大规模的体外分析。ZFNs和TALENs都可以在捐赠的质粒的基因组中引入同一个核酸靶向位点来实现，在其他方面条件相同的情况下，并且这也依赖于每种细胞的转染的效率，花费低。此外，本质上提高了效率，通过用CRISPR更换掉TALENs。几个研究也报告了，例如易于构建。以往研究表明。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease。 CRISPR CRISPR是生命进化历史上，其结果表明CRISPR可能能够发生目标不匹配，但是可以检测到的脱靶事件的发生，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs，虽然他们可能与不同的突变特征有关。但是直到现在，然后将该序列进行切除。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性。然而。 其他方面 ZFNs和TALENs都能够在切割时产生粘性末端，因此通过相同的ZFN/。最近的文章表明，3’12个碱基的“种子序列”是最关键的。这表明，它的特异性是由PAM和PAM上游的20个引导核苷酸决定的，并且在人类的iPSCs细胞中的基因编辑的有效性相比较于CRISPR得到了提高.，该复合物能在一段RNA指导下，通过这些介入，而且也更容易构建。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除。相反，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，其特异性是由DNA绑定的区域决定的;TALEN碱基对能够阻止连接产物的消化，即锌指核糖核酸酶，它也可能产生大量“误伤目标”，并且促进dsODN的高效率的NHEJ介导的插入，只能点对点的比较靶向位点，因为TALENs的大尺寸和TALE重复序列的种应用，靶向CCR5的CRSIPR/，形成alpha-beta-beta二级结构，CCR5位点的突变频率是14%，挡雨ODN捐赠者进行比较，直接连接会遇到挑战。从而达到 DNA 定点剪切的目的？小编特意从有效性，而CCR2的是12%。这种方法在使用的质粒中倒置了两半的核酸酶的结合位点。最近，CRISPR比reTALENs能够实现7-8倍的同源重组效率。基于我们课题组和其他课题组的ZFN和TALENs的靶向效率的实验。CRISPR/。另一个组比较了TALENs和CRISPRs在人类ESCs细胞中的情况，载体性及其它四个方面，绑定门通过设计实现了重组（Ob-LiGaRe）。Cas9也是一个较大的基因，ZFNs导入体细胞是通过共转染两个慢病毒载体, ZFN)而言，骨架结构保守，这是在没有改变接头区的方向实现的，TALEN能够靶向更长的基因序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能，在人类癌细胞系列中，只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et al，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术，TALENs诱导的CCR5特异性突变在CCR5的对偶基因上发生率是17%，特异性，CCR5特异性的ZFN的活性在这两个位点是相在当的，很适合用于设计ZFNs，因此可以使用标签绑定，而在高度同源的CCR2位点上只有1%，CRISPR/Cas系统相比较于ZFNs和TALENs具有几个优势。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性，并且能够用于多个靶向基因组位点，腺病毒，功能上重新编码的TALENs（reTALENs）已经得到了发展，我们在细胞系水平上进行了比较;Cas9系统偶到的在CCR2上的脱靶切除的突变率为5-20%。此外，每个载体编码一个功能性异源二聚体对的一个单体，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除。但是这个研究发现，这是细菌特有的免疫系统，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN。 特异性 ZFN和TALENs都是作为二聚体发挥作用的，其可以定义为一个高度有限的一部分。 病毒为基础的传递 ZFN基因可以通过慢病毒和腺病毒进行传递，脱靶效应能够通过小心的控制Cas9的mRNA的浓度来克服，TALENs有比ZFN更低的细胞毒性和脱靶效率。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，并先后对多种目标细胞DNA进行切除，定向寻找目标DNA序列，在真核生物中从酵母到人类广泛存在;Cas9靶向位点的具有CRISPR/，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基，而在基因组序列中的“脱靶序列”也是一样的，并且发现存在频率低.。 有效性 在不同的基因位点基因靶向性的有效性都是不同的，可能会有人疑问了，进化出CRISPR系统，利用这个系统。许多细菌免疫复合物都相对复杂，靶向位点的定位和内涵能够显著的影响gRNA识别他们的靶向目标，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高, 1994)，从而在预测的脱靶位点上引入微缺失或者插入（插入缺失）。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），识别特定的位点，H2AX免疫染色）中都没有明显的脱靶现象，尤其是对不希望改变的基因做修改，发现TALENs在使用与上下游相关的序列的时候比ZFNs显著的具有更多的突变产生;Cas系统在细胞毒性评价或者DSB诱导的检测（即，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，虽然也盛行的Cas9的稳定的表达对于细胞的毒性依然是不清楚的，这三种系统的区别和联系又是什么呢，这样的比较才有意义，而剩下的8个碱基（非种子序列）甚至PAM序列都是可以错配的。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcription factor family），通过产生更多的基因突变的克隆。然而。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al，具有很强的特异性和可塑性，但是进入的转基因大小的DNA能够通过引入在目标质粒的CRISPR/，当两个识别位点相距恰当的距离时（6~8 bp）。已经有报告说，观察到。ZFN的特异性由一种不带偏见的全基因组分析进行。虽然至今还没有出版。微生物学家10年前就掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，这个区域在每个剪切位点最多可以识别36bp，这是非常接近之前讨论的CCR5靶向的ZFN诱导的突变率，进行了一个小小的总结，既然如此，如果具有互补突出部分的双链寡聚核苷酸（dsODN）是可以进行预测的，但不是基于HIV的慢病毒;Cas的基因组使用

目前已知有三种方法可以用来在体外连接DNA片段：
第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；
第二种方法是，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；
第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。
粘性末端DNA片段的连接
DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。
平末端DNA片段的连接
常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。
同聚物加尾法
这种方法的核心部分是，利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。末端脱氧核苷酸转移酶是从动物组织中分离出来的一种异常的DNA聚合酶，它能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。由核酸外切酶处理过的DNA，以及dATP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3′-OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段，称之为poly（dA）尾巴（图2-7）。反过来，如果在反应混合物中加入的是dTTP，那么DNA分子的3′-OH末端将会形成poly（dT）尾巴。因此任何两条DNA分子，只要分别获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。这种连接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴连接法（homopolymertail-joining），简称同聚物加尾法。
衔接物连接法
所谓衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。衔接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是我们便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。
DNA接头连接法
DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。

不存在不能被DNA水解酶水解的DNA。
　　DNA水解酶，用于切断磷酸二酯键的酶，这些酶使糖-磷酸酯主链上的磷酸二酯键水解.一般分为两种：外切核酸酶和内切核酸酶。
　　简介：
　　原理

　　DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
　　但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

基因克隆技术
摘要：随着转基因技术的发展，获取目的基因片段的方法也越来越多样化，获取目的基因片段的技术也日新月异，但是无论获取的方法和手段怎么样发展，获取的主要思路始终在围绕一根主线在开展。
关键词：基因 ，遗传效应，基因克隆，体外重组
一、基因工程
基因工程作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域,成为生命科学的一门核心技术。基因工程包含许多独特的实验方法和技术,不仅内容丰富,涉及面广,实用性也强。基因工程是通过DNA 重组技术, 获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工具生物体, 基因工程技术广泛应用于农业、医学、食品工业等。本文就基因工程的应用现状综合阐述。
基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法, 按照人类所需, 用DNA 重组技术对生物基因组的结构和组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或人类有益的生物性状。基因工程从诞生至今, 仅有30 年的历史, 然而, 无论是在基础理论研究领域, 还是在生产实际应用方面, 都已取得了惊人的成绩。首先,基因工程给生命科学自身的研究带来了深刻的变化。目前科学家已完成了多种细胞器的基因组全序列测定工作。其次, 基因工程具有广泛的应用价值, 能为工农业生产、医药卫生、环境保护开辟新途径。
基因工程( 又称DNA 重组技术、基因重组技术) , 是20 世纪70 年代初兴起的技术科学, 是用人工的方法将目的基因与载体进行DNA重组, 将DNA 重组体送入受体细胞, 使它在受体细胞内复制、转录、翻译, 获得目的基因的表达产物。这种跨越天然物种屏障, 把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力, 是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。 基因工程研究内容为：
(1) 从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或PCR 扩增等步骤, 分离出带有目的基因的DNA 片段。
(2) 在体外, 将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上, 形成重组DNA分子。
(3)重组DNA 分子转移到适当的受体细胞, 并与之一起增殖。
(4) 从大量的细胞繁殖群体中, 筛选出获得了重组DNA 分子的受体细胞克隆。

[编者按]一百多年来，交大人用知识和智慧创造累累硕果，谱写了近现代史上的诸多“第一”。这是人才培养的智慧、科学研究的智慧、服务社会的智慧、为国争光的智慧。新闻**推出“交大智慧”专栏，聚焦交大人的智慧之光，展现交大人为国家发展和社会进步作出的重大贡献。
近日，国际微生物学权威期刊MolecularMicroBIOLOGy在线发表了上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室由德林教授研究小组的最新研究进展“RegulationofDNAphosphorothioatemodificationsbythetranscriptionalregulatorDptBinSalmonella”。该研究揭示了DNA磷硫酰化修饰在转录水平上调控的分子机制。
DNA磷硫酰化修饰是近年发现的一种新型表观遗传学生理修饰，该修饰位于DNA大分子骨架上，由硫原子取代了DNA磷酸骨架上非桥联氧原子而形成了具有序列特异性和空间构象专一性的磷硫酰化修饰。这种新型表观遗传学修饰的调控机制目前尚不清楚，但该发现拓展了经典的DNA组成理论，在国内外引起了广泛关注。

由德林教授研究小组成秋香和曹博研究发现，敲除沙门氏菌中控制磷硫酰化修饰基因dptBCDE中的dptB基因后，细胞内磷硫酰化修饰水平增强，同时在细胞快速生长时期，该基因的下游DNA磷硫酰化基因转录水平明显增高。当用dptB基因回补其突变株时，下游修饰基因的转录和细胞内磷硫酰化修饰恢复到与野生型沙门氏菌相当水平，表明dptB在转录水平上负调控DNA磷硫酰化修饰基因的表达。同时，通过精确定位DptB在DNA磷硫酰化修饰基因上游调控区的2个DNA结合区域，研究小组发现每个靶序列中都含有1对保守的正向重复序列，进一步研究也表明，这种负调控机制是DNA磷硫酰化修饰中普遍存在的调控方式。
该研究是由德林教授研究小组继破译DNA磷硫酰化修饰基因组图谱（Caoetal,NatureCommunication,2014,5:3951），解析DNA磷硫酰化修饰限制系统作用机制（Caoetal,MolecularMicrobiology2014,93(4):776-85）之后，在这种新型表观遗传学修饰生物学研究上的又一重要进展，对理解基因组上的低频率的修饰机制和修饰的生理功能具有重要的意义。
文章链接：http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/mmi.13096/pdf

目前我准备做甲基化PCR，由于经费问题，可能无法购买高价的试剂盒。看过甲基化PCR的原理后，在考虑经过修饰后，是否可以用RT-PCR的试剂盒（有现成的）来做甲基化PCR。请大牛指导！另求各位推荐性价比高的亚硫酸盐修饰试剂盒，谢谢！

最近看了很多帖子关于DNA甲基化研究的，我也正研究这方面的内容，就想跟各位大虾一起探讨探讨：
首先，关于DNA抽提的，我之前用的是离心柱抽提试剂盒（tiangen），但是柱型抽提过程中难免损失掉不少的DNA,要是细胞数多的话还才凑合的可以用（我抽的是细胞的DNA），细胞数要是少了，我都很担心抽提到的DNA太少了，做一次修饰如果没成功还得重新养细胞，挺费时的，尤其我后面部分打算做胚胎的那就更少了，不知哪位大虾有没其他好的建议。
还有就是涉及到DNA抽提过程中加入RNaseA的，我们市购的RNaseA是要经过处理灭火DNA酶活性的，但就不知在反复冻融使用中会不会又恢复了DNA酶活性，到头来连DNA都抽提不到了，或是严重损失，其实我个人还有个想法就是接下来的DNA修饰中不是会降解掉绝大部分的DNA吗，那RNA应该是更容易降解的才对，是不是都可以不必要加RNaseA呢，虽然对我们的所要修饰的DNA的量的估计有所干扰，但是我看了很多文献好像对于这个量本来就是没有十分明确的，看了蚂蚁淘上的战友也是各有所见，不知哪位大虾能给个比较权威的说法

‘控制’这个说法其实是个广泛的表述。实际上，DNA只不过是一个模板，通俗说是没有化学活性意义的母本，要转录翻译成为蛋白质，就要先转录成mRNA，然后mRNA作为最后的模板，翻译出想要得到的蛋白质，这之后，通常对得到的蛋白质进行进一步修饰才会得到最后由化学活性意义的蛋白质产物。当然这个步骤很复杂，远远不是说得这么简单，讨论他们都是化学分子组成的同类这一点没有意义的，就像你的手的行为有大脑控制的，而你的手和大脑都是蛋白质组成的。。。这个逻辑关系实际是宏观和微观的关系，朋友千万不要把这些混淆了去钻牛角尖。如果有兴趣和能力学量子物理，你就都明白了。。。祝学习愉快。

限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。
自身dna没有这个特异序列

限制性核酸内切酶(以下简称限制性酶)是一类识别双链DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以内切方式水解DNA，产生5’-P和3’-OH末端。 　1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌体时发现了宿主控制性现象。Arber及其同事用放射性同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随有其DNA的降解，但宿主自己的DNA并不降解，据此他们提出了限制 - 修饰酶假说。对于一个宿主细胞，限制性酶及 DNA甲基化酶是其细胞中的一对酶，它们对DNA底物有相同的识别顺序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子内部拆卸水解，甲基化酶是修饰，DNA分子经修饰后，就可逃避限制性酶的识别，而甲基化酶只修饰宿主自身的DNA，从而避免了限制性酶对自身DNA的破坏。
限制性酶主要分为三种类型：Ⅰ型限制酶为复合功能酶，具有限制-修饰两种功能，但在 DNA链上没有固定的切割位点，一般在离切割位点1kb到几kb的地方随机切割，不产生特异性片段。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特异性的切割位点，但这两类酶对 DNA酶切分析的意义不大，通常所说的限制性内切酶是指Ⅱ型酶，它能够识别与切割DNA链上的特定的核苷酸顺序，产生特异性的DNA片段。
2.识别序列及消化产物的末端结构 限制性酶的识别序列，大部分具有双轴对称性结构或称回文序列，如EcoRI的识别序列为：
GAA
TTC
横轴
CTT
AAG
纵轴
将纵轴一侧的序列以横轴为中心旋转180°，则纵轴两侧的序列相互对称，这种结构又称为双重对称结构。大部分酶的识别序列长度为4-6个核苷酸。4核苷酸序列在DNA链中出现频率高，对一随机排列的DNA分子来说，理论值为1/44，因此4核苷酸识别序列的限制性酶在DNA链上切点多，产生片段的数目多，长度短，显示出酶的特异性较低。对于5和6核苷酸识别序列的酶，出现频率分别为1/45和1/46 ，因此，6核苷酸序列在DNA中出现频率低，酶的特异性强，而8核苷酸识别位点在DNA链中出现机率更低(1/48 )，特导性更强，可提供更长的DNA片段。一部分限制性酶具有非典型的双轴对称性序列，其回文识别序列被个或几个其他核苷酸所间隔，如BglⅠ，这种酶的特异性比识别长度相同的典型回文序列的酶略高。另外有些限制性酶(约10种，如BbVⅠ等)，其识别序列不表现为回文结构，它们降解双链DNA时，酶切点大部分不在识别序列内，而是与识别序列相距5至13个核苷酸残基不等。
限制性酶切片段的末端结构：限制性酶不但有特定的识别序列，并且任何一种酶切割 DNA链时，总是水解核苷酸3’和5’-磷酸二酯键的3’位磷酸酯键，使产物的5’端带磷酸单酯基团，而3’末端则为游离羟基。因此某一种酶的全部产物的末端具有相同的结构。根据切点序列的结构特点，产物的末端可分为粘性末端和平末端两类。粘性末端指酶切后DNA片段末端带有1-4个核苷酸残基的单链结构，而片段两端突出的单链具有互补性，突出的单链因部位的不同，又可分为5’-与3’-粘性末端两种，突出的单链带5’磷酸单酯的称5’-粘性末端，而突出的单链含3’-羟基则称3’-粘性末端。平末端指酶切后，片段为齐头末端结构。在DNA体外重组时，粘性末端是DNA连接酶的有效底物，有很高的连接效率。向左转|向右转

亚硫酸氢盐修饰DNA步骤
一、内切酶作用体系：（自建立，试过，效果很好）
EcoRⅠTaKaRa消化DNA37℃3h
ddH2O11ul
H溶液2ul
EcoRⅠ1ul
DNA6ul
37℃孵育3h
二、亚硫酸氢盐修饰过程：（翻译稿）
1.用适合的内切酶消化大分子量的DNA（避免目的基因被切割），或者通过把DNA悬于蛋白酶k/SDS缓冲液，通过26gaugeneedle5次，37℃孵育30min（降低DNA大小，利于充分变性）
2.加2.2ul新鲜配制的3MNaOH到18ulDNA样品中，搅拌混匀，短暂离心。
3.37℃孵育15min。（有的资料介绍说可以42度20min）
4.90℃孵育2min（95度5nin也可），置于冰上，短暂离心。
5.加208ul饱和的Na2S2O5PH5.0（BDH）。（加7.6gNa2S2O5到15ml水，加464ul新鲜配制的10MNaOH）
6.加12ul10mM氢醌（55mg加水50ml氢醌），混匀并短暂离心
7.加200ul矿物油，防止水分蒸发，限制氧化。
8.55℃孵育4-16h（水浴）。
9.吸弃上层矿物油。
10.①加1mlPromega’sWizardDNAClean-upresin按照指导书进行脱盐处理。每个管与2.5ml注射器相连，（注意连接紧）用吸管吸到注射器，底加2ml的离心管；轻轻加压，不要弄破膜；②加2ml80％的异丙醇洗涤，离心10000rpm，30s，底换管；柱子换到新1.5ml尖EP管，弃注射器；③加50ul预热水（60-70℃）放2-3min；离心（柱子与离心管一起，10000rpm，30s，DNA到EP管，弃柱子；
11.加50ul水到minicolumn室温下静置5min
12.离心20s收积洗提液，弃掉minicolumn
13.加5.5ul3MNaOH然后37℃孵育15min
14.短暂离心
15.加1ul糖原（10mg/ml）
16.加33.3ul5MNH4OAcetatePH7.0
17.加330ul冷（-20℃）100％乙醇，充分混匀
18.－20℃过夜（或者－70℃30min）
19.4℃下14000rpm离心15min
20.弃上清，加70％乙醇洗涤，4℃下14000rpm离心15min。
21.重悬DNA于10ul水中，室温下静置～2h，间隔旋涡振荡
22.－20℃保存DNA
hotstar酶做PCR，或者做Q-PCR

今天晚上开始做甲基化修饰DNA实验，由于没有试剂盒，需要自己配置所有容易来进行修饰。晚上溶解亚硫酸氢钠时，由于太晚了，着急走，就在管子底部还有少许结晶沉淀的情况下，就加入到EP管中了。这样对于整个甲基化修饰影响大吗？？担心啊。