E. coli Topoisomerase IV
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E. coli Topoisomerase IV
Topo IV (from Escherichia coli) is prepared by overexpressing the parC and parE subunits in E. coli and purifying them by methods adapted from Peng and Marians, 19991.
The parC and parE subunits are purified to >95% purity as judged by SDS-PAGE. The topo IV is supplied as a heterotetramer complex in Dilution buffer.
It is recommended that the enzyme is aliquoted to avoid repeated freeze-thaw cycles. Store at -80ºC.
All enzyme is supplied with 5X concentrated Assay Buffer and Dilution buffers which are also available separately.
See technical documents below for more detailed information and lot specific activities.
Technical Documents
E. coli Topoisomerase IV Relaxation Assay Kits
These contain the enzyme and the supercoiled DNA substrate in addition to the Assay and Dilution buffers for relaxation reactions. 1 U of topo IV will relax 0.5 µg supercoiled pBR322 DNA in 30 minutes at 37°C.
Technical Documents
E. coli Topoisomerase IV DecatenationAssay Kits
These contain the enzyme and the catenated kDNA substrate in addition to the Assay and Dilution buffers for decatenation reactions. 1 U of topo IV will decatenate 200 ng of kDNA when incubated in 1X Assay buffer in a total reaction volume of 30 µl at 37°C for 30 minutes.
Technical Documents
E. coli Topoisomerase IV Assay Kits for Cell Extracts
These kits are designed for assaying cell extracts and partially purified fractions containing over-expressed topo IV and contain supercoiled DNA substrate, Assay buffer, Dilution buffer, control relaxed DNA and stop buffer/loading dye.
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E. coli Topoisomerase IV Cleavage Assay Kits
These kits are designed specifically for cleavage reactions. They contain topo IV enzyme, supercoiled pBR322 DNA substrate and the Assay and Dilution buffers required for DNA cleavage reactions in addition to the enzyme and linearised pBR322 marker.
Cleavage specific enzyme available separately on request.
Technical Documents
E.coli Topoisomerase IV ATPase kits
These kits can be used to test the effects of potential ATPase inhibitors. For example, the coumarin drugs such as novobiocin inhibit the action of topoisomerase IV by competitively inhibiting the hydrolysis of ATP thus preventing supercoiling.
These assays are microtitre plate-based and thus large numbers of compounds can be screened in a relatively short period of time. They also continuous assays which can provide more information than an end point assay.
Technical Documents
High / Medium-Throughput Assay Kit - E. coli Topoisomerase IV
The kit is supplied with sufficient E. coli topo IV enzyme, plasmid DNA substrate, buffers and other assay components* for 100 assays. The enzyme is supplied at a concentration of 10 U/μl in Dilution Buffer. The kit is also supplied with sufficient wash buffers for one 96-well plate. These buffers are supplied as 20X concentrates and must be diluted with ultra pure water prior to use.
More information about this assay can be found on the "Services" page under "High/Medium Throughput Assay".
Kit issued with limited licence for individual use only.
Patent held by Inspiralis Ltd., Norwich, Norfolk, UK. (Patent No. GB0424953.8, US7838230)
Technical Documents
References
- Peng, H. and Marians, K.J. (1999) Overexpression and purification of bacterial topoisomerase IV, in DNA Topoisomerase Protocols Vol. I (Bjornsti, M-A., and Osheroff, N. eds.), Humana Press, Totowa, N.Jersey pp.163-169
- Maxwell, A., Burton, N.P. and O"Hagan, N. (2006) High-throughput assays for DNA gyrase and other topoisomerases. Nucleic Acid Res. 34 (15), e104
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自身dna没有这个特异序列
限制性核酸内切酶的研究和应用发展很快，已提纯的限制性核酸内切酶有100多种，许多已成为基因工程研究中必不可少的工具酶。
限制性核酸内切酶可被分成三种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。
Ⅰ型和Ⅲ型酶具有限制和修饰两种作用，而特异性弱，切割位点的序列不固定，不已知，不宜用于基因克隆中。
Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA，能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。因此，被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。
第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；
第二种方法是，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；
第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。
粘性末端DNA片段的连接
DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。
平末端DNA片段的连接
常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。
同聚物加尾法
这种方法的核心部分是，利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。末端脱氧核苷酸转移酶是从动物组织中分离出来的一种异常的DNA聚合酶，它能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。由核酸外切酶处理过的DNA，以及dATP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3′-OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段，称之为poly（dA）尾巴（图2-7）。反过来，如果在反应混合物中加入的是dTTP，那么DNA分子的3′-OH末端将会形成poly（dT）尾巴。因此任何两条DNA分子，只要分别获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。这种连接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴连接法（homopolymertail-joining），简称同聚物加尾法。
衔接物连接法
所谓衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。衔接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是我们便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。
DNA接头连接法
DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。
（1）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。
（2）研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。
（3）污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
（二）已经污染，可以加入RNA酶的抑制剂
（1）RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子， 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50％甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物(mammal;mammalian)细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
（2）氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒（1V）离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是量种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译， 并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。
（3）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。
（三）提取核酸时可以加入盐酸胍或硫氰酸胍溶液。盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，从而免受RNA酶的干扰。
分子克隆在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。
工具酶：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶，核酸酶和修饰酶五大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。
DNA水解酶，用于切断磷酸二酯键的酶，这些酶使糖-磷酸酯主链上的磷酸二酯键水解.一般分为两种：外切核酸酶和内切核酸酶。
简介：
原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
昆士兰大学昆士兰大脑研究所（QBI）的高级研究员、神经科学家TimothyBredy博士称，研究团队阐明了如何缓解与恐惧相关的记忆，特别是在恐惧症或创伤后精神压力障碍的病例中。
TimothyBredy博士称，他们已经发现了与消除恐惧有关的基因调控新机制。这种机制是一种抑制性的学习过程，当无需做出反应的时候，这一过程对于控制个体的恐惧至关重要。Bredy说：“基因运作的方式并不是静态的，而是动态变化的，能随着我们每天的生活经验而改变，与情绪有关的事件会产生显著的影响。”
通过了解在不改变内在序列的前提下改变DNA功能的机理，可以为未来开发与恐惧相关的焦虑症靶向疗法提供依据。Bredy说：“通过新型的表观遗传学调控模式对基因实施靶向作用，选择性地加强消除恐惧的记忆，从而达到想要的效果。”
研究团队中的博士生XiangLi说，恐惧消除是个体快速行为适应的一个明显例子。恐惧消除过程中的障碍与焦虑症(恐惧相关的)的出现具有密切联系。Bredy博士称，该研究首次综合分析了DNA修饰如何影响恐惧的消除。参与这项研究的还有来自加州大学欧文分校和哈佛大学的学者。相关研究结果发表在近期的《美国科学院院刊》（PNAS）上。
原文检索：
XiangLi,WeiWei,Qiong-YiZhao,JocelynWidagdo,DanayBaker-Andresen,CharlotteR.Flavell,AnaD’Alessio,YiZhang,andTimothyW.Bredy.NeocorticalTet3-mediatedaccumulationof5-hydroxymethylcytosinepromotesrapidbehavioraladaptation.PNAS,April22,2014;doi:10.1073/pnas.1318906111
