| Test | Specification |
|---|---|
| Thrombin Activity (by coagulation) | > 200,000 US units/g powder |
| Protein (by Biuret) | not specified |
| Thrombin Specific Activity | > 2200 US units/mg powder |
| Moisture | 0 - 5% |
| pH (1% solution) | 6.5 - 7.5 |
| Salt Environment | Glycine, Sodium Chloride |
| Recommended diluent for reconstitution | 0.9% NaCl |
This product is forin vitro(diagnostic) use only. Not for human or animal consumption.
The high purity bovine thrombin (> 2200 U/mg protein) is used by many diagnostic companies worldwide to defibrinate plasma, producing serum matrixes to be used as controls and standards or in polyclonal antibody production. Using bovine thrombin in polyclonal antibody production to defibrinate plasma may increase antibody yields by 15-20% over off-the-clot methods of defibrination. (BioPharm Defibrination Protocol)Our high purity thrombin is also used to cleave His Tags and GST Tags with a high degree of specificity. We express our units in US Units (aka, NIH Units) measured by coagulation. There are approximately 5 Thrombin cleavage units for every one US Unit.
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------发现两种全新的细胞自我防卫机制
来源:上海交通大学
近日,上海交通大学邓子新院士团队对DNA骨架硫修饰生物学意义的研究又获得两项突破。
聚焦核酸研究的著名国际学术刊物《核酸研究》(NucleicAcidsResearch)以特写文章(Featuredarticle)发表了由该团队由德林副教授主持,博士生徐铁刚和姚芬为共同第一作者的论文——“沙门氏菌中与DNA骨架上硫修饰直接关联的一种新的限制系统”。该论文报道了一种新的宿主专一性限制-修饰系统,它与以前所熟知的DNA甲基化限制-修饰系统截然不同,由7个基因负责,其功能与DNA骨架上的硫修饰直接相关。编辑部在特写中写道:“在沙门氏菌中所发现的这种宿主专一性硫修饰系统看来是细菌为了抵御外源对DNA的限制性所装备的又一种新的细胞防卫机制,它被一种新的途径酶所编码,堪比细菌在依赖于DNA甲基化之外加装了又一套新的防御体系。”
与之相反的另一套全新的细胞防卫系统发现于天蓝色链霉菌中,由贺新义副教授主持,博士生刘光为第一作者,以“一种IV型限制内切酶ScoMcrA对硫修饰和甲基化修饰DNA都切割”为题发表在《公共科学图书馆—遗传学》(PLoSGenetics)上,这种酶不仅可以切割DNA骨架上发生了硫修饰的DNA,还可以切割DNA碱基上发生了甲基化修饰的DNA。另外,这套限制-修饰系统分别位于两个相互排斥的基因组岛上,具有“水火不容”的敌对性,两者同时表达会导致细胞瞬时死亡。论文评审员称这是一篇“重要的、epoch-making”的论文。这项发现是上海交大与中国科学院微生物研究所和英国Leicester大学合作的结晶。
这是邓子新院士团队发现DNA骨架硫修饰以来,瞄准科技界普遍关注的有关DNA硫修饰的生物学,尤其是修饰的生理功能这个重大的科学问题公开发表的新的引人注目的原创性成果。与DNA甲基化限制-修饰系统一样,这类新系统的广泛和深度挖掘可能具有重大的分子生物学和生物工程学意义。
目前,DNA骨架硫修饰的研究已成为该团队瞄准前沿,奋力开拓的主要科研方向之一,自他们首次报道DNA硫修饰以来,已先后发表了十余篇相关的系统性研究论文,稳步地把对此新兴领域的研究推向新的高度。
据悉,2010年初,中国微生物学会为了促进、激励和纪念DNA硫修饰这个原创性科学发现,彰显我国基础生命科学领域的显示度和影响力,决定在上海交通大学设立“DNA大分子硫修饰科学发现诞生地”纪念牌。
修饰前有250ng/ul,修饰后只有25ng/ul,请问你们测的修饰后的浓度有多少?我的值正常吗?
这个浓度做pcr行吗?要上多少微升dna啊。
DNA水解酶,用于切断磷酸二酯键的酶,这些酶使糖-磷酸酯主链上的磷酸二酯键水解.一般分为两种:外切核酸酶和内切核酸酶。
简介:
原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
一、内切酶作用体系:(自建立,试过,效果很好)
EcoRⅠTaKaRa消化DNA37℃3h
ddH2O11ul
H溶液2ul
EcoRⅠ1ul
DNA6ul
37℃孵育3h
二、亚硫酸氢盐修饰过程:(翻译稿)
1.用适合的内切酶消化大分子量的DNA(避免目的基因被切割),或者通过把DNA悬于蛋白酶k/SDS缓冲液,通过26gaugeneedle5次,37℃孵育30min(降低DNA大小,利于充分变性)
2.加2.2ul新鲜配制的3MNaOH到18ulDNA样品中,搅拌混匀,短暂离心。
3.37℃孵育15min。(有的资料介绍说可以42度20min)
4.90℃孵育2min(95度5nin也可),置于冰上,短暂离心。
5.加208ul饱和的Na2S2O5PH5.0(BDH)。(加7.6gNa2S2O5到15ml水,加464ul新鲜配制的10MNaOH)
6.加12ul10mM氢醌(55mg加水50ml氢醌),混匀并短暂离心
7.加200ul矿物油,防止水分蒸发,限制氧化。
8.55℃孵育4-16h(水浴)。
9.吸弃上层矿物油。
10.①加1mlPromega’sWizardDNAClean-upresin按照指导书进行脱盐处理。每个管与2.5ml注射器相连,(注意连接紧)用吸管吸到注射器,底加2ml的离心管;轻轻加压,不要弄破膜;②加2ml80%的异丙醇洗涤,离心10000rpm,30s,底换管;柱子换到新1.5ml尖EP管,弃注射器;③加50ul预热水(60-70℃)放2-3min;离心(柱子与离心管一起,10000rpm,30s,DNA到EP管,弃柱子;
11.加50ul水到minicolumn室温下静置5min
12.离心20s收积洗提液,弃掉minicolumn
13.加5.5ul3MNaOH然后37℃孵育15min
14.短暂离心
15.加1ul糖原(10mg/ml)
16.加33.3ul5MNH4OAcetatePH7.0
17.加330ul冷(-20℃)100%乙醇,充分混匀
18.-20℃过夜(或者-70℃30min)
19.4℃下14000rpm离心15min
20.弃上清,加70%乙醇洗涤,4℃下14000rpm离心15min。
21.重悬DNA于10ul水中,室温下静置~2h,间隔旋涡振荡
22.-20℃保存DNA
hotstar酶做PCR,或者做Q-PCR
(1)玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染,使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间(玻璃器皿)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂,但其作用并不是绝对的(Fedorcsak和Ehrenberg,1966)。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时,然后用灭菌水淋洗数次, 并于100℃干烤15分钟(Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净,再用水冲洗,用乙醇干燥,然后灌满3%的H2O2溶液,于室温放置10分钟,然后用0.1 %DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记,存放在指定地点,为RNA实验专用。
(2)研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此,在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时,主有涉及RNA的一切操作过程中,都应戴一次性手套,接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此进行RNA实验时应勤换手套。
(3)污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1%DEPC于37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注:DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
(二)已经污染,可以加入RNA酶的抑制剂
(1)RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合(KI≈3x1010)形成非共价结合的等摩尔复合物,使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂,血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子, 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂,该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的50%甘油中,贮存于-20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用,因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此,在使用变性剂裂解哺乳动物(mammal;mammalian)细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂,并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂,故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂,而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
(2)氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒(1V)离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物,是量种过渡态类似物,它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中,在RNA提取和纯化的所有过程中,其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译, 并能作为某些外酶促反应(如mRNA反转录)的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译,因此必须用含0.1 %羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。
(3)Macaloid(硅藻上)Macaloid是一咱粘土,很多年前就发现它能吸附RNA酶,用缓冲液将其制成浆液,以0.015%(W/V)的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中(如酚抽提后)经离心去除。
(三)提取核酸时可以加入盐酸胍或硫氰酸胍溶液。盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质,从而免受RNA酶的干扰。
具体包括:DNA聚合酶α/引发酶(引发及后随链的部分合成),DNA聚合酶δ(DNA复制主要酶),增殖细胞核抗原(滑动夹子,与合成连接性有关),拓扑异构酶(母链DNA拓扑异构化),解(螺)旋酶(能解开DNA双螺旋),单链DNA结合蛋白及复制蛋白(单链DNA结合作用),复制因子C(参与滑动夹子的装配),DNA连接酶(连接冈崎片段及参与修复),核酸酶(去除RNA引物),侧翼核酸内切酶(去除RNA引物)。
总体作用是在DNA复制过程中发挥的,在DNA复制过程中起到关键性的作用。
以上信息详见高等教育出版社《生物化学》一书第十二章:DNA的生物合成。
限制性核酸内切酶的研究和应用发展很快,已提纯的限制性核酸内切酶有100多种,许多已成为基因工程研究中必不可少的工具酶。
限制性核酸内切酶可被分成三种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP,全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。
Ⅰ型和Ⅲ型酶具有限制和修饰两种作用,而特异性弱,切割位点的序列不固定,不已知,不宜用于基因克隆中。
Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA,能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。因此,被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。
第一代热启动Taq酶是一种DNA聚合酶。 第一代指的是直接从Taq(这是一种细菌)体内提取的天然聚合酶,没有进行化学修饰的,为了达到更好的聚合催化效果,往往需要经过酶工程处理,得到的聚合酶催化效率更高。 热启动是指这种酶的反应温度条件
Taq DNA polymerase是从克隆有Thermu aquaticus DNA Polymerase基因的大肠杆菌经诱导表达后,再经过柱纯化分离出来的一个约94 KD的重组蛋白。无外源核酸酶和细菌DNA污染,稳定性好,特异性强,适用于常规PCR扩增。

