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| 实验方法原理 | 限制性内切酶能够特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 标准pUC19（2686bp） 试剂、试剂盒 | EcoRI及其配套的酶切缓冲液0.5×TBE电泳缓冲液6×LoadingBufferGoldview琼脂糖 仪器、耗材 | 水平电泳仪水浴锅移液器微波炉成像设备 实验步骤 | 1.在200ul的离心管中，按照下表加入试剂（单位：ul），混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃保温2h进行酶切反应。  2.反应结束后，加入2ul 10×LoadingBuffer钝化酶活性；（或：65℃，保温20min使酶失活）。 3.电泳检测。 酶切阴性对照：pUC19标样+10×LoadingBuffer2ul 酶切样品：标准pUC19酶切样品10ul+10×LoadingBuffer2ul 4.质粒及酶切样品电泳预期结果。  注意事项 | 影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切（星号活性）。 其他 | 可以采用无缝克隆作为替代方案进行基因重组。 |
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发布于 ： 2021-09-23
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