T4DNA连接酶酶连接总是连接不上
2017-03-05
问题描述：
菌体构建时，目的基因连接在T载体上，测序也正确，但是将目的基因还有载体分别双酶切后总是连接不上，将连接后产物跑核酸胶，什么也没有，不知道是什么原因？我的目的基因浓度为9ng/ul,载体回收后的浓度为6ng/ul,是因为浓度太低的原因吗？还有就是连接有目的基因的T载体双酶切后出现了三条带，这个又是什么原因呢？希望得到解答
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mpark
用户
What is the vector for this subcloning? What are the two enzymes used for this cloning? How big is the insert DNA? What is the ligation reaction and how is transfomation performed?
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zweiguang
用户质粒酶切后三条带据说是超螺旋线性环状三种你是要连还是要切我没太搞懂连的话首先要有目的片段一般由PCR获得引物上设计酶切位点及保护碱基PCR产物酶切质粒酶切然后二者均经过胶回收纯化然后连接目的片段也可以以质粒为模板进行PCR获得关键要连上目的片段的酶切位点与质粒上的酶切位点要一致注意方向要保证方向正确通常两端用不同的酶切位点且切完后形状，粘性末端序列，长度最好有明显差别
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wnan2320
用户mparkWhatisthevectorforthissubcloning?Whatarethetwoenzymesusedforthiscloning?HowbigistheinsertDNA?Whatistheligationreactionandhowistransfomationperformed?酶切位点是BamHI和AATII因为两种酶不能进行双酶切只能先BamHI但酶切再AatII酶切。插入基因1000bp左右载体片段8000bp左右用T4连接酶反应酶1ulbuffer2ul目的基因3ul载体8ul水6ul感受态确定没有问题酶也是刚买的但就是连不上做了好几次了
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wnan2320
用户展开引用wnan2320酶切位点是BamHI和AATII因为两种酶不能进行双酶切只能先BamHI但酶切再AatII酶切。插入基因1000bp左右载体片段8000bp左右用T4连接酶反应酶1ulbuffer2ul目的基因3ul载体8ul水6ul感受态确定没有问题酶也是刚买的但就是连不上做了好几次了......转化后抗性平板不长菌
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wnan2320
用户展开引用zweiguang质粒酶切后三条带据说是超螺旋线性环状三种你是要连还是要切我没太搞懂连的话首先要有目的片段一般由PCR获得引物上设计酶切位点及保护碱基PCR产物酶切质粒酶切然后二者均经过胶回收纯化然后连接目的片段也可以以质粒为模板进行PCR获得关键要连上目的片段的酶切位点与质粒上的酶切位点要一致注意方向要保证方向正确通常两端用不同的酶切位点且切完后形状，粘性末端序列，长度最好有明显差别......方向没有错，现在问题是我的目的基因和目标载体连接不上，目的基因和载体分别先用BamHI单酶切再用AATII酶切后，胶回收用T4连接酶连接，但转化大肠后总是不长菌
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mpark
用户Howdidyouprepare1000bpinsertDNA,cutfromotherconstruct,oramplifyitfromPCR?IfitisfromPCR,trytomakeblunt-endligationfirst.
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zweiguang
用户我看了一下，这两个酶切出的粘性末端都是四个碱基，我不会选择这么长粘性末端的酶，我觉得它会断。也不会选择用两个酶进行两次酶切，两次胶回收。浓度会严重下降。建议重新选酶，尽量选酶切条件一致的，同时进行酶切，然后胶回收，然后连接。
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wnan2320
用户因为我的载体上就四个酶切位点，第一个和第二个紧挨着，第四个酶切是平末端，所以只能选这两个酶切位点。另外这两个酶不能同时双酶切，所以才分别单酶切的，我也不想分别单酶切的。真的是好苦恼呀。。。。。。
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吴倩倩1
用户你的目的基因和载体酶切后有跑胶吗？最好给个图看看，你的链接比例是多少？
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薄荷味的小黑
用户T载体是pmd-19的还是pmd-18的啊?
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