| Description | FLPrecombinasecatalyzesthesite-specificrecombinationofDNAbetweenFRTsites.Ithasbeenwidelyusedforgeneratingconditionalknockoutmice,mediatedbyFLP/FRTsystem. Recombinantcell-permeantFLPrecombinaseTat-FlpwaspurifiedfromanHEK293celllineoverexpressingFLPRecombinasefromyeastSaccharomycescerevisiaewithadditionalN-terminal6XHistag,aTatpeptide(GRKKRRQRRRPPAGTSVSL)andanNLSsequence(PKKKRKV).Inaddition,this"Thermostable"mutantFLP(P2SL33SY108NS294P)has~4-10foldhigheractivitythanwild-typeFLPat37°C. |
| Applications | exvivoFRTrecombination. |
| QC | Additionof100unitsofTat-FlptoFRT-RFP-Stop-FRT-GFP293Treportercellsresultedin60~90%recombinationefficiency.  Figure1:Tat-Flptransductionefficiencyisconcentrationdependent. 1:noTat-FLP;2~8:adding5,10,25,50,75,100and200unitsofTat-FLPtoHEK293TcellstransfectedwithFRT-RFP-Stop-FRT-GFPplasmidDNA.Picturesweretaken4daysaftertransductionwithvariousamountofTat-FLP |
| UnitDefinition | Astandardof100UnitsisdefinedastheamountofTAT-FLPin1.0mLoftissueculturemediumthatisrequiredtoinduce50% GFPexpressioninaHEK293Treportercelllineassay. |
| Source | Sf9cells |
| Storage | -20~-80°C. |
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
近几年来，基因重组的技术层出不穷，包括TALEN和CRISPR/Cas9在内的重组技术给基础研究提供更为方便和快捷的分子生物学工具。
关于这些技术的具体原理和操作细节，这里不做展开介绍，主要谈一谈在用这些技术进行细胞株构建的过程中，如何做才能加快阳性克隆筛选的步伐,做好这个关键的步骤。
一.混合克隆pool验证
质粒转染后48-72小时后取转染后细胞的pool1000个细胞以上离心，去上清，PBS洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS中，煮5min后模板就制备好了，剩余的pool细胞做有限稀释，一般5块板足够。
分析敲除位点的上下游序列，设计合适的引物PCR扩增目的基因片段，与野生型目的基因杂交后CruiserTM酶切15-20分钟，酶切产物1.5%-2%凝胶电泳。
上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。这一步尤为重要，很多杂志投稿时需要这张图，或者有计算突变率的要求。
二.阳性克隆筛选
上一步采用有限稀释法接种到96孔板中的克隆，待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时，取出其中的一半细胞提取基因组。分析敲除位点的上下游序列，设计合适的引物，并从提取的基因组中扩出目的片段，然后选择CruiserTM或者T7EI进行酶切分析，最后将酶切分析得到的阳性克隆再进行测序进行最终确认。
为了可以很快的筛选到阳性克隆可以通过如下几个方式去进行优化：
1、尽可能提高单细胞的存活率
a)对于单个细胞很难存活的细胞，如果是贴壁细胞，可以试着加一些细胞因子促进细胞的分裂；而对于悬浮细胞，则推荐采用CellPlaza（共培养的原理），都可以极大的提高细胞的存活率；
b)对于很容易老化的细胞，推荐对细胞进行永生化改造，永生化的方法有很多，这里不做具体推荐。
2、采用能够快速抽提微量样品基因组DNA的试剂盒
这样的试剂盒，市面上也比较多，但是需要注意选择针对样品量比较少的试剂盒，建议选择Qiagen或者Genloci的微量样品的抽提试剂盒。QIAGEN是老品牌，Genloci这家公司是主要做基因重组的，所以，他们开发的一些产品针对性比较强，而且价格便宜，建议优先使用。
3、设计合理的引物和选用高保真的Taq酶
引物设计推荐选择靠近靶位点上游100bp和下游200bp处，或者上游200bp和下游100bp处，这样的好处是后面进行酶切分析的时候，对于阳性的克隆，可以很容易观察到2条分开的条带。
Taq酶，建议是用NEB的Fusion或者Q5，毕竟敲除本身很大可能也就是2-3个碱基的缺失，所以，高保证是必要的，防止产生假阳性的结果。
4、选择高特异性的错配酶
目前用的比较多的是CELI和T7EI两种酶，CELI是植物来源的一种特异性识别碱基错配的酶，活性高，不会产生假阳性。目前市面上只有CruiserTM和Surveyor和两个品牌。其中Surveyor是进口代理产品，价格较贵，货期较长；CruiserTM价格合适，同时货期短，国内可以2-3天内到货，做到真正质优价廉。
T7EI是NEB的产品，最早并不是为了做基因敲除筛选用的。其最主要的特点是除了识别错配外，还可以识别十字型结构DNA、Holliday结构或交叉DNA、异源双链DNA，正是因为这个特点，很容易导致假阳性的现象。
测序公司往往是比较容易忽略的一个环节，很多人送测序后，拿到的测序结果经常发现没信号，就认为是自己的样品有问题，而不会去怀疑测序公司。实际上是错误的思维方式，测序是苦力活，人员流动比较大，所以经常会发现某一段时间的测序结果总是不好，实际上跟样品无关而跟测序公司的人员流动有很大关系。所以，一定要找一些资质比较好的测序公司，同时，发现问题的时，可以考虑换一家公司再测一遍。
缺点：质粒仍然较大，转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
2月16日，美国专利及商标局传来重磅消息——该部门宣布，隶属于哈佛大学与麻省理工学院的Broad研究所继续保有2014年获批的CRISPR-Cas9应用专利，也让这项**性基因编辑工具的专利之争大体尘埃落定。
▲三行文字，决定了这项专利的归属（图片来源：STAT）
毫无疑问，CRISPR-Cas9基因编辑系统是本世纪最为重要的生物发现之一。2015年，《科学》将它评为年度突破；助力这项技术诞生的科学家们也先后获得了有“科学界奥斯卡”之称的“突破奖”（BreakthroughPrize），在分子生物学界影响深远的“格鲁伯遗传学奖”（GruberGeneticsPrize），以及表彰重大生物医学突破的“沃伦·阿尔珀特奖”（WarrenAlpertPrize）。
CRISPR-Cas9基因编辑系统能取得今天的成功，绝非一名科学家的功劳。2012年，JenniferDoudna教授与EmmanuelleCharpentier教授在《科学》杂志上发表文章，确认CRISPR-Cas9系统在体外实验中能“定点”对DNA进行切割。两个月后，VirginijusSiksnys教授在《PNAS》杂志上发表了类似的研究。这些论文表明CRISPR-Cas9系统作为基因编辑工具的巨大潜力。
2013年，张锋教授的研究团队在《科学》杂志上发表了一篇重磅研究：他们首次在哺乳动物内应用了CRISPR-Cas9系统，并确认它能在几周内建立起小鼠的疾病模型。此外，张锋教授的团队也首次在人体细胞内成功地用CRISPR-Cas9系统完成了基因编辑。
▲张锋教授团队率先在哺乳动物细胞中应用了CRISPR-Cas9技术（图片来源：STAT）
科学突破需要群策群力，专利申请却并非如此。2012年，加州大学伯克利分校与Broad研究所/麻省理工学院先后向美国专利及商标局递交了CRISPR应用的专利申请。2014年4月，美国专利及商标局为后者率先颁发了专利，而前者的申请至今未得到批准。加州大学伯克利分校认为，Doudna教授与Charpentier教授等人的研究在CRISPR的应用中起到了奠基性的作用，因此Broad研究所获得的专利值得商榷。2016年1月，美国专利及商标局展开了进一步的调查，并于今日做出判决——三名法官认为“nointerferenceinfact”。
业内媒体STAT在一则报道中指出，这短短的四个单词，意味着Broad研究所在2014年获得的关键性CRISPR专利，与加州大学递交的专利申请有足够多的不同。
▲CRISPR相关专利申请一览
“我们递交的专利并非首个与CRISPR应用相关的专利，但它们是首批描述这一发明用于哺乳动物基因组编辑的专利。”Broad研究所在今天发布的一份声明中提到。
值得一提的是，今日的专利判决并不会影响CRISPR-Cas9系统在科学界的应用。作为一家非营利性科研机构，Broad研究所乐于将突破性的发现分享给全球科学界，造福人类健康。因此，Broad研究所也将继续与Addgene（非营利性质粒库）合作，分享这一重要研究工具。自2013年以来，全球59个国家的2000多家研究所已经从Addgene处获得了37000多个与CRISPR-Cas9相关的质粒与试剂。此外，Broad研究所也在今日发表的声明中宣布，将继续为业界的合作伙伴们提供相关研发工具。
张锋博士是麻省理工学院历史上最年轻的华人终身教授。去年，张锋教授作为“下一代领袖”（NextGenerationLeaders）之一，登上了《时代周刊》亚洲版的封面。在报道中，《时代周刊》认为他的工作给CRISPR-Cas9系统带来了巨大变革，让科学家们能够完成先前不敢设想的工作。如今，我们有望能清除每一个受感染细胞中的艾滋病病毒，或是治疗镰刀状红细胞贫血症等经典的遗传疾病。甚至，科学家们已经畅想利用它来攻克癌症的可能。此外，它也能在植物的基因组中得到应用。这能带来全新的生物能源，或带来性状更稳定的作物。
我们期待看到CRISPR-Cas9带来更多有望造福人类的应用！
参考资料：
[1]FORJOURNALISTS:STATEMENTANDBACKGROUNDONTHECRISPRPATENTINTERFERENCEPROCESS
[2]BroadInstituteprevailsinheateddisputeoverCRISPRpatents
[3]张锋教授登上《时代周刊》封面：编辑基因组的下一代领袖
大家好，我是CRISPR新手。在设计一个白蛋白基因相关的sgRNA，但是白蛋白的序列有17多kb，很多设计工具都无法导入。请问大家我这个问题该怎么解决呀？？
科学家发现，细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后，可以获得其部分DNA（脱氧核糖核酸）片段并整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，转录出相应的RNA（核糖核酸），利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR／Cas9技术就是利用这一原理，用一种定制的RNA引导Cas，对预设DNA位点进行切割，造成DNA断裂，启动细胞内基因组修复机制，实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
我想问一个基础问题啊，用CRISPR/cas系统敲除某个基因后，如果突变株表型没法通过肉眼分辨，怎么把突变株找出来？要用到什么Marker吗？还是需要对细胞逐个测序检测？
如果是逐个检测，那就涉及到效率问题了，当效率比较低的时候，岂不是工作量很大？
还有cas9基因会残留在细胞里吗？
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。
CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。向左转|向右转
基因敲除技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，自身发展的同时也促进了相关技术的进一步发展。流程大概是这样的：首先获得小鼠ES细胞系，测试ES细胞嵌合入受体囊胚的能力之后根据不同基因、不同目的设计并构建打靶载体，将打靶载体转入一定数目ES细胞中，然后鉴定出带有发生正确同源重组的突变中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，是的经过修饰的遗传信息经生殖系遗传，从而得到带有修饰基因的突变小鼠，而后可以对其进行表型分析。
目前，在ES细胞中进行同源重组已经成为一种研究特定基因甚至基因的特定结构域和对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。1997年通过基因打靶获得的突变小鼠就已经超过千种，近年来随着基因敲除技术的不断进步，尤其是DNA重组技术和小鼠基因组测序的完成，使得建立基因敲除小鼠的周期大大减少，使基因敲除小鼠数目大大增加。各国也都建立了突变体小鼠及转基因小鼠的数据库。
06年8月七日，美国国立卫生研究院宣布将投巨资启动敲除小鼠基因组计划，目的是建立一个完善、免费的小鼠基因组突变基因数据库，研究人员可以利用基因敲除小鼠研发能为治疗癌症、心脏病、神经退行性疾病、糖尿病等人类遗传疾病提供更为优秀的动物模型。展开
暂无品牌分类
