While CRISPR/Cas9-mediated gene editing is a powerful technique for genome manipulation, two significant challenges remain: obtaining efficient delivery of Cas9 and the gene-specific single guide RNA (sgRNA) to all cell types, and achieving fewer off‑target effects. To address these challenges, we have developed cell‑derived nanovesicles called gesicles that are created using the Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System. CRISPR/Cas9 gesicles contain active Cas9 protein complexed with an sgRNA specific to a gene of interest, and mediate binding and fusion with the membrane of a wide range of target cells.
While CRISPR/Cas9-mediated gene editing is a powerful technique for genome manipulation, two significant challenges remain: obtaining efficient delivery of Cas9 and the gene-specific single guide RNA (sgRNA) to all cell types, and achieving fewer off‑target effects. To address these challenges, we have developed cell‑derived nanovesicles called gesicles that are created using the Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System. CRISPR/Cas9 gesicles contain active Cas9 protein complexed with an sgRNA specific to a gene of interest, and mediate binding and fusion with the membrane of a wide range of target cells. These features can increase gene-editing efficiency to levels that are often higher than those obtained using plasmid‑based delivery methods. Additionally, this method allows for tight control of the dose and duration of the Cas9‑sgRNA complex in the cell, with the added benefit of reduced off‑target effects. The nanovesicles are produced in a Gesicle Producer 293T Cell Line via co-overexpression of packaging-mix components, including a nanovesicle-inducing glycoprotein and a protein for cell-surface display that mediates binding and fusion with the cellular membrane of target cells. Simultaneous overexpression of the Cas9 protein from Streptococcus pyogenes and a target-specific guide RNA (sgRNA) results in incorporation of the Cas9-sgRNA complex within the gesicles. After the resulting Cas9-sgRNA gesicles are harvested and applied to your target cells, they will efficiently enter the cells and mediate efficient gene editing.
This system provides the components needed for cloning and expressing your target-specific guide RNA, plus packaging reagents for producing CRISPR/Cas9 gesicles. The Gesicle Producer 293T Cell Line is sold separately.
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一、Cas9简介
二、如何设计gRNA
三、如何快速克隆gRNA
四、如何制作基因敲除、基因敲入和条件性敲除
A
B
C条件性敲除
目前的条件性敲除小鼠主要是基于Cre-LoxP系统的。Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
传统的条件性敲除
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
传统方法，首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
第二步，通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。在细胞水平上，可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除；在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。
一般需要一年以上的时间，价格在15-20万不等。
基于Cas9系统的条件性敲除
原理上和传统的条件性敲除类似，差别在于利用OptimizedCas9/CRISPRSystem(OCAS)技术在基因组上加入loxp序列，可以快速获得Loxp位点插入的小鼠。
一般只需要4-5个月。价格也比传统方法大大降低。
五、如何制作基因敲除小鼠
因为技术和仪器的缺陷，一般实验室都不太会做到这一步。
mark先定格框架慢慢写
还开了另外一个帖子讲Cas9技术本身及在细胞生物学上的应用。也欢迎交流。
Cas9基因敲除技术详述-蚂蚁淘论坛
CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶，也就是 Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。
将 CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个 Cas 酶，用于切断靶标 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一个就是称为导向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与 Cas 形成复合物，指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变 Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。
“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制。近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。
不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRN 互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNA 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS，以及几十个不同的 ZFNs，来证明其中一个有效。
近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中 Cas 和 gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。
如何 CRISPR 我的靶标？
由于 CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达 Cas 和 gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一种 Cas 的变体，即 Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由 RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链，也能切断其互补链。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。
基因敲除、阳性单克隆筛选、真核细胞、斑马鱼、基因组、植物
CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，用以抵御病毒和质粒入侵。在II型CRISPR系统中，CRISPRRNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activatingcrRNA,tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strandbreaks,DSBs）。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。
剪刀手生物专注于基因编辑多年，最新推出基因组编辑工具CRISPR/Cas9专家系统，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。CRISPR-Cas9体系为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。
作为一种新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9有以下特点和优势：
1、操作简单，靶向精确性更高。
2、CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传。
3、基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等
4、可实现对靶基因多个位点同时敲除。
5、无物种限制。
6、实验周期短，最快仅需1个月，节省大量时间和成本。
CRISPR/Cas9的应用中，活性检测或是突变效率的检测：
错配酶法靶序列经Cas/sgRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，即可反映出Cas/sgRNA的活性。
也因此，CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”，大有一副取而代之的势头。
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。
CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。向左转|向右转
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近年来，CRISPR/Cas9风暴席卷全球。这项基因组编辑技术在短短几年内迅速应用于世界各地的实验室，并催生了上千篇文章的发表。然而，麻省理工学院（MIT）的《Technology Review》杂志提出了一个问题，谁才是CRISPR技术的所有者？生物通 www.ebiotrade.com
一个月前，“科学突破奖”（Breakthrough Prize）揭晓。加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和德国亥姆霍兹传染研究中心的Emmanuelle Charpentier因在CRISPR技术方面的重要贡献而获奖，且每人获得了300万美元的奖金。
这一领域的另一位风云人物，Broad研究院的张锋（Feng Zhang）虽然没有获得科学突破奖，但在今年4月获得了CRISPR/Cas9的首个专利。他的研究中心控制着这一技术的每个重要商业应用。生物通 www.ebiotrade.com
那么问题来了，这个备受瞩目的奖项和专利为何会落入不同人的手中？究竟是谁发明了它？“这一领域的知识产权相当复杂，”CRISPR Therapeutics公司的CEO Rodger Novak谈道。Emmanuelle Charpentier是这家公司的创始人之一。
Tech Review的记者Antonio Regalado指出，张锋与Doudna共同创立了Editas Medicine公司，它获得了Broad的技术授权。不过，在张锋成功申请专利之后，Doudna就与该公司断绝了关系。她将她的知识产权（专利申请中）授予了另一家竞争性的公司Intellia Therapeutics。然而，让事情更加复杂的是，Charpentier又将她在同一专利申请中的权利出售给了CRISPR Therapeutics。生物通 www.ebiotrade.com
此外，围绕这一技术的科学信用，那也是错综复杂。2012年夏天，Doudna、Charpentier及她们的团队发表了一篇文章，证明CRISPR/Cas9系统可以作为一种可编程的DNA编辑工具。半年后，张锋博士以及哈佛大学的George Church发表文章称它可应用于人类细胞，不久后，Doudna也发表了类似的结果。
但是，张锋表示他对Doudna和Charpentier的工作知之甚少。为了支持他的专利申请，他提交了实验室笔记本的照片，表示他在2012年年初就开始了这方面的研究，早于Doudna和Charpentier。生物通 www.ebiotrade.com
Charpentier表示：“我可以说的是，我和Jennifer Doudna是在我的实验室中开展研究。这里的一切都很夸张，因为这是一项人们很容易学会的技术。事情发生得太快了。”
Regalado在文中写道：“目前还没有CRISPR药物。但是如果CRISPR真的如科学家想象得那么重要，对这一基本技术的商业控制将价值数十亿美元。”也许，这场专利之战才刚刚开始。（生物通 薄荷）
