Generaterandomgeneknockoutsinnon-E.colibacteria
- Generatemutantswithimprovedgeneticsorfunction
- Identifygenesinvolvedinpathogenesis,toxicity,biofilmdevelopment
- Unravelmetabolicpathways
- Identifyessentialgenesandregulatoryelements
- Characterizenovelgenesandgenefunctions
- InsertKanselectableMarkerintogDNAandrescueclonesinE.colihostexpressingthepirgeneproduct
- 100’sofcitationsformanydifferentapplications
Applications
- Rescuecloningoftransposon-mutagenizedmicrobialgenes(Fig.1).
- Rescueofplasmidsfromnon-E.colibacteria.
AmongtheadvantagesoftransposonmutagenesisisthatthetransposonservesasamarkerthatcanbeusedtocloneandsequencetheregionofgenomicDNAthathasbeendisrupted.NothingmakesthiscloningprocesseasierthancreatingmutationsinvivowiththeEZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>TnpTransposome™Kit.*Inadditiontoencodingabroadhost-rangekanamycinresistancegene,thetransposoncontainsanE.coliconditionaloriginofreplication(R6Kγori).Thepresenceofthisoriginofreplicationenablesthepropagationor"rescue"oftheregionofgenomicDNA,orplasmid,intowhichthetransposonhasbeeninserted.
First,electroporatetheTransposomeintoelectrocompetentcellsofthehighestpossIBLetransformationefficiency.ActivationoftheTransposomebyMg2+inthecellresultsintherandominsertionoftheEZ-Tn5<R6Kγori/KAN-2>Transposonintothehost'sgenomicDNA.Selecttranspositionclonesonkanamycinplatesorbyscreeningforthelossofgenefunction.
Benefits
- EasilyrecoverandpropagateplasmidsfromdiversebacterialgenerathatwillnotnormallyreplicateinE.coli.
- Simplerescuecloningprocessofmutagenizedgenesspeedsupstructure/functionstudiesandsequencing.
- RandominsertionoftransposonDNAassuresexcellentcoverageofentirebacterialchromosome.
- Rescueclonescanbesequencedbidirectionallyusingtheprimersprovidedthatarehomologoustotheendsofthetransposon.
| Figure1(clicktoenlarge).TheprocessforrescuecloningoftransposoninsertionsitesingenomicDNAusingtheEZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>TnpTransposome™andTransforMax™EC100D™pir+orTransforMax™EC100D™pir-116ElectrocompetentE.coli. |
*Coveredbyissuedand/orpendingpatents,exclusivelylicensedorassignedtoEpicentre®(anIllumina®Company).
ORDERINFORMATION
EZ-Tn5™<R6Kyori/KAN-2>TnpTransposome,KAN-2FP-1ForwardPrimer,R6KAN-2RP-1ReversePrimer,SterileWater.ebiomall.com
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近期，上海公卫临床研究中心的一位研究生应用两种转染试剂Turbofecttransfectionreagent（Thermo）和EntransterTM-R4000（Engreen）进行了一次RNA转染比较。比较情况如下：
实验方法
转染试剂：Turbofecttransfectionreagent（Thermo）和EntransterTM-R4000（EngreenBiosystemCo,Ltd）
待处理细胞：humanCD8+T细胞
1.针对Turbofect转染的方法
每孔培养体积均为100μL，细胞数目在105左右。
取0.5μLagomir，加入9.5μL无血清RPMI1640，充分混匀；
取0.2μLTurbofecttransfectionreagent和agomir稀释液充分混合。
转染复合物制备完成；混匀后室温下孵育15-20分钟，直接取10μL加入已铺好细胞的孔中，继续培养24h收取细胞，用PBS洗涤3次以上，以备RNA抽提。
转染Mix的配制：100nMago/N.C.：（0.5μLagomir+0.2μLTurbofect+9.3μL无血清的RPMI1640）×2.5=1.25+0.5+23.25
2.EntransterTM-R4000转染
每孔培养体积均为100μL，细胞数目在105左右。
取0.5μLagomir，加入9.5μL无血清RPMI1640，充分混匀，制成10μLagomir稀释液；
取0.25μLEntransterTM-R4000，然后加入9.75μL无血清稀释液体，充分混匀，制成10μLEntransterTM-R4000稀释液；
将EntransterTM-R4000稀释液和agomir稀释液充分混合（可用振荡器或加样器吹吸10次以上），室温静置15分钟。
转染复合物制备完成；
将20μL转染复合物加入孔中的细胞悬液中，前后移动培养皿，混合均匀；
转染后6h观察细胞状态，并更换培养基，继续培养24h后收取细胞，用PBS洗涤3次以上，以备RNA抽提。
转染Mix的配制：100nMago/N.C.：（0.5μLagomir+9.5μL无血清的RPMI1640）×2.5=1.25+23.75；Etranster稀释液：（0.25μLEtranster+9.75μL无血清的RPMI1640）×5=1.25+48.75（室温静置5分钟），取20μL至ago和N.C.管中，室温静置15分钟。
实验结果
结论：从目的miRNA表达水平的检测结果来看，转染24h后，英格恩生物公司（EngreenBiosystem）的EntransterTM-R4000(ago/NC:422912倍)转染试剂的效果优于Turbofect转染试剂(ago/NC:285870倍)。
讨论：从实验结果来看，英格恩生物公司（EngreenBiosystem）的EntranstenTM-R4000(ago/NC:422912倍)转染试剂的效果优于Turbofect转染试剂(ago/NC:285870倍)。EntransterTM-R4000是英格恩生物（EngreenBiosystem）最新研发合成的针对siRNA、microRNA、mimic、inhibitor、mRNA和shRNA等RNA的转染试剂。EntransterTM-R4000不仅可以转染小RNA，而且针对mRNA等长链RNA优化。该试剂可将RNA导入多种细胞系，包括原代细胞和悬浮细胞。无论有无血清、抗生素存在均可获得很高的转染效率。
但是在选择的时候，也需要注意其他的一些问题。
1、采用何种原料和抗体，是否高效、灵敏、特异
2、规范包被操作，吸附是否均匀
3、重复性、可靠性
6、是否提供技术服务
7、适用于血浆、血清、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等多种类型的样本
8、可检测动物类型是否丰富
9、可检测指标是否齐全
elisa试剂盒就查下博欧特生物
使用方法：
1、 血清：操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。
2、 血浆：EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、 细胞上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。
5、 保存：如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
—DNA转染试剂Polyjet-适用于普遍的哺乳动物细胞
LipoD293-适用于悬浮细胞的转染（包括昆虫细胞SF9）-对于普遍的哺乳动物细胞具有更优异的转染效率
—DNAandsiRNA转染试剂
Lipojet-适用于大多数哺乳动物细胞的转染-低毒性（无需换液）-用量少-DNA/RNA共转染（co-transfection）-效果优于Lipofectamine2000
—siRNA转染试剂
GenMute-适用于大多数哺乳动物细胞转染-低毒性（无需换液）-用量少-DNA/siRNA共转染（co-transfection）PepMute-适用于普遍的哺乳动物细胞的转染
如题，PolyplusTransfection转染试剂在中国区的代理商有哪些？求推荐1-2个靠谱的，谢谢！
想用RNAiMAX或者lipo2000转染siRNA，但是看了下转染试剂的说明书和锐博的siRNA说明书，觉得分别对siRNA的用量描述差别挺大的呀，不知道到底该参考哪个呢。
以24孔板为例在siRNA说明书中写到，siRNA终浓度是50nM的话，加入浓度为20μM的siRNA1.25ul，每孔体积是500ul，那这样的话，每孔最终siRNA的量是25pmol。
但是在RNAiMAX或者是lipo2000说明书中，一个写的每孔siRNA用量是5pmol，一个是500ng，这与siRNA厂家所提供的量相差也太多了吧。
到底该看哪一个呢。
ps.一旦siRNA的量和体积确定下来之后，转染试剂的量和siRNA1:1的加就可以了吗？
请各位大神解答。
1.siRNA说明书中的用量，红线圈出
2.RNAIMAX说明书中siRNA的用量。
3.lipo2000说明书中siRNA用量
